水蛭素對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質損傷及MCP-1、ICAM-1的干預效應研究*

任 桐，朱鵬宇，楊洪濤

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381）

腎間質纖維化（RIF）屬于腎臟纖維化的一部分，是慢性腎臟病（CKD）進展為終末期腎臟病（ESRD）過程中重要的病理過程。在RIF發生的早期，凝血酶可通過激活腎間質內毛細血管內皮細胞表面蛋白酶激活受體（PAR-1），引起腎間質內毛細血管內皮細胞產生一系列趨化因子及黏附分子如單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等，致使單核/巨噬細胞等炎癥反應細胞向腎間質遷移浸潤，進一步釋放轉化生長因子-β1（TGF-β1）等細胞因子，最終引起RIF。本實驗從凝血酶這一角度入手，旨在探討水蛭素對腎間質纖維化過程的干預機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質量（180±20）g，購自北京華阜康生物科技有限公司。

1.1.2 實驗藥物 天然水蛭素凍干粉，購自湖北武漢勝天宇生物科技有限公司；鹽酸貝那普利片，購自北京諾華制藥有限公司。

1.1.3 實驗儀器 BX60顯微鏡，購自OLYMPUS；Mini-PROTEAN 3電泳芯，購自 Bio-Rad；FluorChem FC2 Imaging System，購自 Alpha Innotech；Epgiadients PCR儀，購自 Eppendorf；ABI 7500 fast熒光定量PCR儀，購自Life Technologies。

1.1.4 實驗試劑 10%甲醛溶液、二甲苯、系列乙醇、中性樹膠，購自天津血液研究所病理科；牛血清白蛋白（BSA，V900933），購自 Sigma-Aldrich；Allin-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit（AORT-0060），購 自 GeneCopoeia；Trizol（115596026）、Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG（C11733-046），購自 invitrogen；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（G1120）、RIPA裂解緩沖液（R0010），購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（NCI3225CH），購自 Thermo Fisher；PVDF 膜（IPVH00010），購自 Millipore；ECL（sc-2048），購自Santa Cruz；兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體（ab25124）、兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體（ab124760）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體（ab6721），購自 abcam。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方案 健康雄性SD大鼠120只，體質量（180±20）g，隨機分為假手術組、模型組、水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組、貝那普利組，每組各24只。1.2.2 大鼠UUO模型制備 對模型組、水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組、貝那普利組均建立大鼠UUO模型：大鼠經腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后固定，于下腹部正中位置切口1．5 cm，游離左側輸尿管并結扎切斷，使左腎完全梗阻。對假手術組僅游離左側輸尿管，不結扎切斷。術后每只大鼠均應用20萬單位青霉素注射行抗感染治療3 d。

1.2.3 實驗過程 術后第1天起，水蛭素高劑量組均給予水蛭素（84 U/kg，1次/日）皮下注射，水蛭素低劑量組均給予水蛭素（42 U/kg，1次/日）皮下注射，貝那普利組均給予鹽酸貝那普利片溶于生理鹽水后（2 mL，1次/日）灌胃，假手術組、模型組均給予生理鹽水（2 mL，1次/日）皮下注射。每組分別于術后第3、7、14天時，隨機選擇8只大鼠處死，取梗阻側腎組織，部分制作石蠟切片以備病理檢測，其余部分放入液氮保存并制作冰凍切片，以備逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測。

1.2.4 病理檢測 用二甲苯、系列乙醇將石蠟切片脫蠟并水化；加入蘇木素染液，室溫下靜置20 min；自來水沖洗5 min；加入分化液，室溫下靜置30 s；浸入自來水15 min；加入伊紅染液2 min；自來水沖洗5 min；自來水浸泡5 min；脫水、透明、封片，鏡下觀察其腎小管等腎間質結構形態變化、淋巴細胞、單核/巨噬細胞浸潤情況及纖維組織形態。

1.2.5 RT-PCR檢測 取出100 mg冰凍組織保存于Eppendorf管中；加入1 mLTrizol溶液，用電動勻漿機進行勻漿；室溫下靜置15 min；加入0．2 mL三氯甲烷，振蕩混勻；室溫下靜置10 min后，4℃下離心（12 000 r/min，10 min）；取上清液轉移至另一新Eppendorf管中；加入0．5 mL異丙醇，在室溫下靜置10 min 后，4 ℃下離心（12 000 r/min，10 min）；棄去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀物2次，每次5 min，4℃下離心（8 000 r/min，10 min）；室溫下干燥；加入100μLDEPC水以重懸；按照試劑盒說明書，用Allin-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，用Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG進行擴增；取擴增產物5μL，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果，用β-actin作參照，MCP-1、ICAM-1 相對表達水平采用 2-ΔΔCT公式計算[1]。

1.2.6 Western Blot檢測 采用Western Blot方法檢測腎組織中MCP-1、ICAM-1的表達。方法如下：取出冰凍組織，加入RIPA裂解緩沖液，冰上勻漿，4℃下離心（12 000 r/min，20 min）后保存于Eppendorf管中；取50μL裂解物，測定蛋白質濃度；取等量蛋白質及β-Actin進行SDS-PAGE，100 V下電泳1 h；轉移至PVDF膜；加入含5%奶粉的TBST溶液室溫下靜置1 h；加入含5%奶粉的TBST溶液稀釋一抗，4℃下孵育過夜；用TBST沖洗PVDF膜3次，每次5 min；加入含5%奶粉的TBST溶液稀釋二抗，室溫下孵育1 h；用TBST沖洗PVDF膜3次，每次5 min；用TBS沖洗PVDF膜5 min；加入ECL，室溫下避光靜置10 min以顯色；曝光顯影。

1.2.7 統計學方法 實驗所得數據采用SPSS22．0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差（x±s）表示，數據多組間比較采用單因素方差分析（one-way Anova），組間兩兩比較采用 LSD 法，以 P＜0．05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 假手術組術后各時間點未見明顯病理改變。模型組自術后第3天可見腎小管輕度擴張，腎間質輕度水腫，單核/巨噬細胞少量浸潤；第7天可見腎小管進一步擴張，腎小管上皮細胞空泡變性，腎間質內單核/巨噬細胞等炎癥細胞浸潤增多，纖維組織輕度增生；第14天可見腎皮質、髓質變薄，腎小管結構破壞，出現腎小管萎縮，基底膜部分消失，腎小管上皮細胞壞死，纖維組織明顯增生，腎間質內淋巴細胞、單核/巨噬細胞大量浸潤。與模型組相比：水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組、貝那普利組腎間質損傷均有不同程度減輕。具體見圖1。

2.2 Western Blot檢測

2.2.1 MCP-1蛋白質相對表達量 與假手術組相比：模型組各時間點及水蛭素低劑量組第3、7天MCP-1蛋白質相對表達量顯著增加（P＜0．01）；水蛭素高劑量組、貝那普利組第3、7天及水蛭素低劑量組第14 天 MCP-1 蛋白質相對表達量增加（P＜0．05）。與模型組相比，水蛭素高劑量組第14天MCP-1蛋白質相對表達量顯著減少（P＜0．01）；水蛭素高劑量組第3、7天及貝那普利組第3、14天MCP-1蛋白質相對表達量減少（P＜0．05）。具體見表 1。

圖1 HE染色結果（×200倍）Fig.1 HE staining results（× 200）

表1 MCP-1蛋白質相對表達量（±s）Tab.1 Protein expression of MCP-1（±s）

表1 MCP-1蛋白質相對表達量（±s）Tab.1 Protein expression of MCP-1（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 第3天 第7天 第14天假手術組 0．50±0．03 0．48±0．03 0．53±0．04模型組 1．02±0．10** 0．92±0．10** 0．89±0．08**水蛭素高劑量組 0．67±0．04*# 0．66±0．05*# 0．51±0．04##水蛭素低劑量組 1．00±0．08** 0．84±0．08** 0．80±0．07*貝那普利組 0．79±0．05*# 0．80±0．07* 0．60±0．05#

2.2.2 ICAM-1蛋白質相對表達量 與假手術組相比：模型組各時間點ICAM-1蛋白質相對表達量均顯著增加（P＜0．01）；水蛭素低劑量組、貝那普利組各不同時間點ICAM-1蛋白質相對表達量均增加（P＜0．05）。與模型組相比：水蛭素高劑量組第7天ICAM-1 蛋白質相對表達量顯著減少（P＜0．01）；水蛭素高劑量組第3、14天及水蛭素低劑量組第14天、貝那普利組各不同時間點ICAM-1蛋白質相對表達量均減少（P＜0．05）。具體見表 2。

2.3 RT-PCR檢測

2.3.1 MCP-1 mRNA相對表達量 與假手術組相比：模型組各時間點、貝那普利組第3天MCP-1 mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0．01）；水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組各不同時間點及貝那普利組第 7、14天 MCP-1 mRNA 相對表達量升高（P＜0．05）。與模型組相比：水蛭素高劑量組第7、14天MCP-1 mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0．01）；水蛭素高劑量組第3天及水蛭素低劑量組、貝那普利組各不同時間點 MCP-1 mRNA 相對表達量降低（P＜0．05）。具體見表3。

2.3.2 ICAM-1 mRNA相對表達量 與假手術組相比：模型組各不同時間點ICAM-1 mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0．01）；水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組及貝那普利組ICAM-1 mRNA相對表達量均升高（P＜0．05）。與模型組相比：水蛭素高劑量組、貝那普利組各不同時間點及水蛭素低劑量組第7、14天ICAM-1mRNA 相對表達量均降低（P＜0．05）。具體見表4。

表2 ICAM-1蛋白質相對表達量（±s）Tab.2 Protein expression of ICAM-1（±s）

表2 ICAM-1蛋白質相對表達量（±s）Tab.2 Protein expression of ICAM-1（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 第3天 第7天 第14天假手術組 0．54±0．04 0．55±0．04 0．57±0．05模型組 1．00±0．09** 0．92±0．09** 0．99±0．09**水蛭素高劑量組 0．67±0．07# 0．51±0．05## 0．63±0．07#水蛭素低劑量組 0．88±0．08* 0．84±0．08* 0．82±0．07*#貝那普利組 0．76±0．71*# 0．71±0．06*# 0．80±0．07*#

表3 MCP-1 mRNA相對表達量（±s）Tab.3 The mRNA expression of MCP-1（±s）

表3 MCP-1 mRNA相對表達量（±s）Tab.3 The mRNA expression of MCP-1（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 第3天 第7天 第14天假手術組 1．00 1．00 1．00模型組 1．87±0．31** 1．98±0．26** 2．10±0．33**水蛭素高劑量組 1．33±0．13*# 1．27±0．17*## 1．25±0．18*##水蛭素低劑量組 1．52±0．23*# 1．45±0．18*# 1．39±0．21*#貝那普利組 1．47±0．20**# 1．52±0．22*# 1．45±0．23*#

3 討論

作為CKD進展為ESRD的主要病理過程，RIF一直是研究的熱點。目前，尚未發現能抑制甚至逆轉RIF過程的特效藥物。RIF的主要表現包括細胞外基質（ECM）增多與腎小管上皮細胞轉分化（TEMT）。

CKD進展至ESRD過程中，腎臟長期處于缺血、缺氧狀態。有害內環境可使氧自由基、細胞因子、內毒素及凝血酶等濃度升高。其中，凝血酶能激活腎間質毛細血管內皮細胞表面PAR-1，進而激活多種信號通路，導致腎間質毛細血管內皮細胞釋放大量細胞因子、黏附分子如MCP-1、ICAM-1等，引起一系列病理過程，如Grandaliano等[1]的研究表明PAR-1表達的增加與纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）表達的減少能促進RIF發生過程中ECM的蓄積；Mercer等[2]的研究證實在肺纖維化過程中PAR-1的激活能誘導肺泡上皮細胞釋放MCP-1增多，進而從多種途徑引起肺纖維化；Rahman等[3]的研究證實PAR-1能激活毛細血管內皮細胞核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路，從而促進 ICAM-1 轉錄。由上述研究可知PAR-1的激活能誘導細胞MCP-1、ICAM-1表達上調，這與對應器官纖維化過程有著密切的聯系。

表4 ICAM-1 mRNA 相對表達量（s）Tab.4 The mRNA expression of ICAM-1（±s）

表4 ICAM-1 mRNA 相對表達量（s）Tab.4 The mRNA expression of ICAM-1（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05。

組別 第3天 第7天 第14天假手術組 1．00 1．00 1．00模型組 1．57±0．25** 1．62±0．26** 1．69±0．26**水蛭素高劑量組 1．23±0．12*# 1．29±0．20*# 1．27±0．18*#水蛭素低劑量組 1．42±0．21* 1．37±0．19*# 1．44±0．22*#貝那普利組 1．35±0．18*# 1．31±0．17*# 1．40±0．21*#

MCP-1對單核/巨噬細胞有趨化和激活作用[4]；ICAM-1主要功能是使單核細胞激活并與內皮細胞緊密黏附后穿出血管壁到達炎癥部位[5]。腎間質內毛細血管內皮細胞釋放MCP-1、ICAM-1后可引起單核/巨噬細胞激活并定向遷移、穿出毛細血管壁到達腎間質中，引起一系列炎癥反應。激活的單核/巨噬細胞能釋放TGF-β1，而TGF-β1已被大量研究證實能引起ECM分泌增多，能促進腎間質纖維化的發生與發展。Yang等[6]的研究證實TGF-β1能誘導TEMT；而Zheng等[7]的研究則證實MCP-1可直接作用于腎小管上皮細胞，引起TEMT發生。與此同時，MCP-1與ICAM-1能直接影響ECM的合成，如Lee等[8]的研究指出在MCP-1能誘導腹膜間皮細胞發生EMT及ECM過度積聚；Paccosi等[9]的研究則表明應用MCP-1合成抑制劑可抑制腎功能惡化過程，且這一作用可能與其減少了腎間質中ECM過度沉積有關。ICAM-1在誘導單核/巨噬細胞激活與黏附過程之外，也能通過誘導ECM過度沉積導致腎功能惡化，如Janssen等[10]使用ICAM-1基因敲除小鼠證實了ICAM-1在腎損傷過程中可導致ECM過度沉積及腎功能進行性惡化。

結合目前研究現狀，設計了本實驗，旨在研究通過對凝血酶的干預，是否能對與RIF密切相關的MCP-1、ICAM-1兩種標志物造成影響，從而在一定程度上抑制RIF的發生、發展，并研究凝血酶抑制劑水蛭素在上述一系列病理過程中的保護性作用。從MCP-1、ICAM-1等方面入手，以UUO大鼠為模型，進行了為期14 d的研究。結果顯示：水蛭素高劑量組及水蛭素低劑量組均能不同程度地減輕UUO模型大鼠腎間質損傷程度并抑制MCP-1、ICAM-1的表達，且水蛭素高劑量組相比水蛭素低劑量組有著更好的效果。在相同的劑量下，隨著給藥時間的延長，水蛭素對MCP-1、ICAM-1表達的抑制作用可持續增強，如水蛭素低劑量組第3天ICAM-1 mRNA相對表達量及第3、7天ICAM-1蛋白質相對表達量無統計學意義（P＞0．05），但在第 14 天時，水蛭素低劑量組ICAM-1 mRNA及蛋白質相對表達量相比模型組均有一定降低（P＜0．05）。

綜上所述，通過本實驗研究，可得出如下結論：水蛭素能不同程度地減輕UUO模型大鼠腎間質損傷程度并下調MCP-1、ICAM-1 mRNA及蛋白質的表達，且水蛭素高劑量組的下調作用更強。因此，水蛭素能在一定程度上下調RIF發生過程中腎間質血管內皮細胞表達的趨化因子、黏附因子水平，從而抑制單核/巨噬細胞趨化與激活，減輕單核/巨噬細胞浸潤及炎癥反應，達到抑制腎間質纖維化發生、發展的目的。其作用機制或與水蛭素抑制UUO模型大鼠腎間質血管內皮細胞凝血酶活性，進而下調腎間質MCP-1、ICAM-1 mRNA及蛋白的表達有關。