博耶和科恩重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所證明的生物學(xué)內(nèi)涵

劉紅蕾 聶劉旺

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 安徽蕪湖 241000）

2018年全國(guó)高考卷Ⅰ第38 題是一道選做題，分值為15 分，其中的第1 小題：博耶和科恩將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。 該研究除證明了質(zhì)粒可以作為載體外， 還證明了__________ （答出2 點(diǎn)即可）。 該題的標(biāo)準(zhǔn)答案是：體外重組質(zhì)粒可進(jìn)入受體細(xì)胞并表達(dá)（4 分，其他合理答案可酌情給分）。

博耶（H. Boyer）和科恩（S. Cohen）是現(xiàn)代基因工程的重要奠基者， 在他們之前還有一批科學(xué)家同樣為基因工程的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)Berg 博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組， 第1次成功地在體外將猿猴病毒SV40 的DNA 和λ 噬菌體的DNA 分別進(jìn)行酶切， 再用連接酶將其重組，結(jié)果獲得了雜合DNA 分子［1］。 這給生命科學(xué)研究者帶來(lái)了巨大的啟發(fā)， 不同來(lái)源的原核生物DNA 片斷可在體外重組得到雜合DNA 分子。 隨后，在1973年，斯坦福大學(xué)的Cohen 等［1］也成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外重組實(shí)驗(yàn)， 并實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這表明原核生物的DNA 不僅可在體外重組，甚至重組后的DNA 分子仍然可在大腸桿菌中繁殖。自此，基因工程在1973年正式問世。但是僅在原核生物中被實(shí)驗(yàn)證明可實(shí)現(xiàn)。一年后，科恩和博耶進(jìn)行了這道題中所描述的實(shí)驗(yàn)， 即將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞， 并實(shí)現(xiàn)功能的表達(dá)。這一結(jié)果，極大沖擊了人們對(duì)生物種間界限的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)， 而這一結(jié)果又能夠說(shuō)明什么生物學(xué)內(nèi)涵？這道高考題正是以此為背景，要求學(xué)生寫出該實(shí)驗(yàn)所證明的生物學(xué)內(nèi)涵。 筆者歸納總結(jié)了上述實(shí)驗(yàn)所證明的論點(diǎn)， 以期能給教師在進(jìn)行這部分內(nèi)容的教學(xué)時(shí)提供更多的教學(xué)啟發(fā)， 也幫助學(xué)生在學(xué)習(xí)基因工程這一新興生物技術(shù)時(shí)能更好地理解其中的操作原理。

1 重組質(zhì)粒可進(jìn)入受體細(xì)胞

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA 之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA 分子［2］。 它在很多原核細(xì)胞中都存在，自然狀態(tài)下可在原核細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。 由于質(zhì)粒上有一個(gè)至多個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)，因此，可將外源基因?qū)胫临|(zhì)粒中， 再由質(zhì)粒運(yùn)載至原核細(xì)胞中。博耶和科恩進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后仍可導(dǎo)入大腸桿菌， 且可以像在自然狀態(tài)下一樣進(jìn)行自我復(fù)制或整合至染色體DNA 上， 并隨染色體DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終表達(dá)。 該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在基因工程中，質(zhì)粒可作為運(yùn)載體。

在進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)， 通常都是利用質(zhì)粒作為載體的。 其優(yōu)勢(shì)不言而喻，主要表現(xiàn)為：

1）質(zhì)粒具有自我復(fù)制的能力。 當(dāng)外源基因?qū)胭|(zhì)粒后，質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞可獨(dú)立自我復(fù)制，不受擬核染色體DNA 復(fù)制的影響，即具有自身的復(fù)制原點(diǎn)。

2）質(zhì)粒不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞造成傷害。 質(zhì)粒本身就是細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)， 對(duì)于細(xì)胞而言不屬于外來(lái)物，因此，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞造成傷害。

3）質(zhì)粒DNA 分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)。 質(zhì)粒可被限制酶切割開，供外源DNA 片斷（基因）插入其中。

4）質(zhì)粒DNA 分子上有特殊的標(biāo)記基因。當(dāng)重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞，需要對(duì)重組DNA 進(jìn)行鑒定和選擇， 標(biāo)記基因即可幫助人們挑選出符合要求的細(xì)胞， 例如常用的四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因等。

2 真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)并實(shí)現(xiàn)物種間的基因交流

真核生物和原核生物遺傳信息的儲(chǔ)存方式是不同的， 真核生物的遺傳信息儲(chǔ)存在細(xì)胞核中的染色體DNA 上，而原核生物則是儲(chǔ)存在擬核中的染色體DNA 上，且不同物種的基因在自然狀態(tài)下相對(duì)較難進(jìn)行交流和融合， 但通過人工改造的方式，摒棄生物有性繁殖的基因交流方式，改為人工操作的無(wú)性繁殖即可有效提高不同物種之間基因交流的成功率。在博耶和科恩進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，非洲爪蟾核糖體蛋白基因就是真核細(xì)胞中控制蛋白質(zhì)合成的基因， 而大腸桿菌是最常見的原核受體細(xì)胞，最終基因可表達(dá)，說(shuō)明已實(shí)現(xiàn)了爪蟾與大腸桿菌間的基因交流。

因?yàn)樵松锎蠖嗑哂畜w積小、繁殖快、多為單細(xì)胞生物且遺傳物質(zhì)較少等特點(diǎn)，因此，常被用于真核生物體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的受體細(xì)胞。 基因工程也正是利用真核細(xì)胞的遺傳物質(zhì)可在原核細(xì)胞中表達(dá)這一事實(shí)，大量生產(chǎn)人類所需要的，但在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽。 可利用原核生物生產(chǎn)大量的基因工程藥物， 為更多的疑難雜癥患者帶來(lái)康復(fù)的希望， 例如白血病在20 世紀(jì)40年代之前一直被認(rèn)為是不治之癥， 但現(xiàn)代基因工程技術(shù)則給白血病患者帶來(lái)康復(fù)的希望， 最早研制出的抗CD33 抗體為鼠源性IgG2 抗體-M195，可治療急性髓性白血病，但由于人會(huì)對(duì)此產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)而限制了其臨床應(yīng)用。現(xiàn)在可利用基因工程使鼠源性IgG2 抗體－M195 的恒定區(qū)序列（即抗體分子的輕鏈和重鏈中靠近C 端相對(duì)穩(wěn)定的氨基酸序列）被人源序列所取代，成為人源化的M195－HuM195，然后利用原核生物大量生產(chǎn)，使得更多患者有康復(fù)的可能［3］。 還有人們很熟悉的治療糖尿病的胰島素，于1978年9月由美國(guó)基因工程技術(shù)公司研制。通過在細(xì)菌體內(nèi)植入胰島素基因，人類從此不再需要從豬、牛等動(dòng)物體內(nèi)獲取胰島素。 這不僅開啟了生物工程藥物的新紀(jì)元，也給全世界糖尿病患者帶來(lái)了福音，具體應(yīng)用過程如圖1。

圖1 利用基因工程合成胰島素過程示意圖

3 幾乎所有生物都共用一套遺傳密碼子

在細(xì)胞中將mRNA 翻譯為蛋白質(zhì)的過程中，堿基與氨基酸之間是通過密碼子配對(duì)的，mRNA上3 個(gè)相鄰的堿基決定了1 個(gè)氨基酸， 這3 個(gè)堿基就是1 個(gè)密碼子。 該實(shí)驗(yàn)中非洲爪蟾的基因能在大腸桿菌中表達(dá)， 說(shuō)明非洲爪蟾和大腸桿菌是共用一套密碼子的。通過大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，目前大多數(shù)生物使用的密碼子具有通用性， 但也發(fā)現(xiàn)極少數(shù)例外。 在支原體中，終止密碼子UGA 被用于編碼色氨酸；在四膜蟲（Tetrahymena）及草履蟲（Paramecium）等一些纖毛蟲中,UGA 是唯一的終止密碼子，UAA 和UAG 編碼谷氨酰胺；而在游仆蟲的一些基因中，通用終止密碼子UGA 不作為終止信號(hào),而是編碼半胱氨酸［4］。 此外，在對(duì)人、牛及酵母線粒體DNA 序列和結(jié)構(gòu)的研究中，也發(fā)現(xiàn)一些密碼子使用的特殊情況。線粒體與核DNA 密碼子使用情況相應(yīng)的對(duì)比如表1 所示。

表1 線粒體與核DNA 密碼子使用情況的比較［5］

由此可見，密碼子不僅具有通用性，同時(shí)還具有一定的特殊性。 因此在選擇受體細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量避開使用這些具有特殊密碼子的生物， 以免在進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)生翻譯的錯(cuò)亂。 除了某些生物具有特殊的密碼子外， 不同物種使用密碼子的偏好性也不同， 主要是由于不同的生物攜帶不同的反密碼子tRNA 含量是不同的， 例如在大腸桿菌中， 就發(fā)現(xiàn)AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA 和GTC 共8 種稀有密碼子。當(dāng)導(dǎo)入外源基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)，如果稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)，則會(huì)抑制一些蛋白質(zhì)的合成，發(fā)生翻譯的錯(cuò)誤［6］。 所以，要想使導(dǎo)入的外源基因成功表達(dá)也是需要進(jìn)行篩選和檢測(cè)的。

4 生物體內(nèi)有機(jī)大分子的構(gòu)成都遵循共同的規(guī)則

從分子生物學(xué)的角度出發(fā)， 生物的物質(zhì)構(gòu)成其實(shí)具有簡(jiǎn)單原則：

1）所有生物的構(gòu)成分子種類相似，例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、糖等，都是以碳原子為核心，且通過共價(jià)鍵的形式與其他一些原子構(gòu)成， 本質(zhì)上可以說(shuō)是相通的。

2）構(gòu)成生物大分子的單體也幾乎都一致。 蛋白質(zhì)分子都是由大約20 種氨基酸通過脫水縮合、盤曲折疊形成的，DNA 都是由4 種脫氧核糖核苷酸形成，RNA 也都是由4 種核糖核苷酸形成的。

因此，在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能利用受體細(xì)胞中游離的核苷酸， 翻譯過程也可利用受體細(xì)胞中游離的氨基酸。 此過程并不會(huì)因?yàn)樵系牟町惢驑?gòu)成方式的不同導(dǎo)致外源基因無(wú)法表達(dá)。

通過這樣一個(gè)簡(jiǎn)單的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)， 人們不僅能證明重組質(zhì)粒可進(jìn)入受體細(xì)胞、 真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)， 并實(shí)現(xiàn)物種間的基因交流，以及幾乎所有生物都共用一套遺傳密碼子，同時(shí)， 也能從分子層面證明生物體內(nèi)有機(jī)大分子的構(gòu)成都遵循共同的規(guī)則。

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》明確提出現(xiàn)階段的高中生物學(xué)教學(xué)要以培養(yǎng)學(xué)生的生命觀念、 科學(xué)思維、 科學(xué)探究和社會(huì)責(zé)任為目標(biāo)。 教師更應(yīng)注重教材概念或科學(xué)實(shí)驗(yàn)等背后所蘊(yùn)含的生物學(xué)原理，讓學(xué)生知其然，知其所以然。通過一道高考題便能帶來(lái)如此多的思考， 教材中還有諸多值得深思的內(nèi)容等待教師帶領(lǐng)學(xué)生進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)。