草魚自噬相關基因Beclin1的克隆及其在MC-LR脅迫下的表達特征

何 麗 阮記明 劉 毅 付建平 劉 林 隗黎麗

(1. 江西農業大學動物科學技術學院, 南昌 330045; 2. 江西師范大學生命學院, 南昌 330022)

微囊藻毒素(Microcystins, 簡稱MCs)是一類具有生物活性的單環七肽化合物, 是銅綠微囊藻等藍藻產生的次生代謝產物[1]。到目前為止, 在已知結構的100多種MCs變體中, 微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MC-LR, 其中L代表亮氨酸)是毒性最強、危害最嚴重的一種肝毒素[2]。此外, MC-LR還能夠在水生動物的腎臟、心臟、性腺和肌肉等組織器官中積累, 通過食物鏈的傳遞最終威脅人類健康[3,4], 已有的研究報道表明其主要的致毒機理是抑制絲∕蘇氨酸蛋白磷酸酶l和2A(PP1和PP2A)的活性以及誘導氧化應激[5,6], 從而引起細胞骨架重組、DNA受損及氧化和抗氧化系統平衡失調等, 最終導致細胞凋亡和細胞壞死[7]。盡管已取得了一系列的研究進展, 但仍難以全面詮釋MC-LR毒性機制。現已有零星報道表明自噬與MC-LR的肝毒性密切相關, 如Menezes 等[8]發現人(Homo sapiens)的肝臟細胞暴露在低濃度的MC-LR中時, 可見自噬小體的產生; MC-LR也可引起小鼠(Mus musculus)肝細胞產生自噬[9]。然而, MC-LR誘導魚類自噬的研究相對較少, 其誘導自噬發生的機制也尚不明確。

已有的研究表明自噬是細胞體內多余的蛋白質和亞細胞成分在溶酶體內消化降解的過程, 被認為是一種選擇性的非caspase依賴的程序性細胞死亡[10]。大量研究表明, 自噬可由饑餓、內質網應激、低氧、病原體感染和細胞器受損等多種因素誘導[11], 該過程受30多種自噬相關基因的調控。其中Beclin1, 是酵母自噬相關基因Atg6的同源基因,是在1998年由Liang等在致死性Sinbis病毒性腦炎的大鼠(Rattus norvegicus)中發現的[12], 1999年Aita等[13]首次成功克隆了大鼠Beclin1基因。然而,Beclin1在魚類中的研究卻相對較少, 目前只有在斑馬魚(Danio rerio)[14]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[15]、荷包紅鯉(Cyprinus carpio)[16]和稀有鯽(Gobiocypris rarus)中[17]有相關報道。

草魚(Ctenopharygodon idella)作為一種重要的淡水經濟魚類, 是我國養殖規模最大、產量最高的淡水養殖魚類, 在池塘集約化養殖模式下, 草魚極易遭受MCs的威脅。在我們先前的研究中, 經轉錄組測序研究發現, 草魚受MC-LR脅迫后, 肝臟差異表達基因中包括Beclin1等自噬相關基因[18]。此外,到現在為止還未見Beclin1在草魚中的克隆及其對MC-LR響應的報道, 因此, 本文在此研究基礎上, 通過RACE-PCR技術獲得草魚Beclin1(命名為CiBeclin1)基因的全長cDNA序列, 并對其cDNA和推導的氨基酸進行了生物信息學分析, 同時分析在MCLR脅迫下草魚肝臟Beclin1基因的表達變化情況,為進一步研究MC-LR的毒性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗草魚購于江西省南昌神龍漁業公司, 平均體重為(22.13±2.17) g。試驗所用MC-LR為 Taiwan Algal Science Inc 公司產品, 間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)為Sigma公司產品, RNA提取試劑盒TRIzol reagent為Invitrogen公司產品, 用于合成不同組織表達的逆轉錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 以及熒光定量PCR 的SYBR Green Real-time PCR Master Mix為Promega公司產品, 進行RACE擴增的第一鏈cDNA用Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech)試劑盒合成、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 載體和T4 DNA Ligase購自TaKaRa公司。

1.2 試驗魚的處理及樣品的分離

試驗草魚買回后先在室內暫養2周, 暫養期間每日按照魚體重的2.0%進行投喂, 并保持水溫在(20 ± 0.2)℃。試驗前48h停止投喂并將草魚進行隨機分組, 即對照組和2個劑量處理組, 每組設置3個重復。在試驗前, 根據產品說明書將MC-LR (純度≥95%)粉末用甲醇溶解成1 μg/μL的母液保存備用, 在正式染毒之前用0.8%生理鹽水稀釋成為25 μg MC-LR/kg體重(25 μg MC-LR/kg body weight, 25 μg MC-LR/kg BW)和100 μg MC-LR/kg BW, 每尾魚注射量為0.1 mL, 對照組草魚注射等量的0.8%的生理鹽水。在染毒24h、48h、72h和96h后, 分別從實驗組和對照組中各取6尾魚。在解剖前, 先用100 μg/mL的MS-222將魚麻醉, 然后迅速分離新鮮的肝臟, 置于液氮中保存。

1.3 核酸的提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

取出保存在液氮中的樣品, 采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA, 具體提取方法參考試劑盒的說明書進行。用于RACE 擴增的cDNA按照Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit 操作手冊的方法合成, 用于檢測不同組織表達以及MC-LR誘導表達的第一鏈cDNA用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成。

1.4 CiBeclin1 cDNA全長的獲得

根據轉錄組測序數據獲得Beclin1一段序列[18],先設計簡并引物驗證該EST序列(表1), 引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR擴增條件為95℃預變性3min, 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 90s, 共35個循環, 72℃延伸10min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳、切膠和回收純化后克隆到pMD18-T載體(TaKaRa, Tokyo, Japan) , 然后再轉化到感受態TOP10, 進行藍白斑篩選, 菌液PCR檢測陽性克隆,并送上海生工生物技術有限公司測序, 獲得中間片段。

CiBeclin1 cDNA 3′端片段克隆根據已獲得中間片段序列擴增共設計2條特異性引物RC3-1和RC3-2, 并且RC3-1在RC3-2的上游(表1)。擴增時,用RC3-1和3′RACE 接頭引物做第一次PCR擴增, 擴增條件為94℃預變性3min; 94℃ 30s, 58℃ 30s,72℃ 90s, 共20個循環; 72℃延伸10min。產物稀釋后再用RC3-2和3′RACE 擴增試劑盒中的接頭引物做巢式PCR, 隨后篩選陽性克隆進行測序。

CiBeclin1 cDNA 5′端片段克隆根據已獲得中間片段序列而設計的特異性引物(RC5-1、RC5-2和RC5-3)(表1)。按照SMARTTMcDNA Amplification Kit (Clontech) 說明書推薦的反應體系及反應條件進行5′端擴增, 最后將獲得的5′擴增片段回收, 純化后連入pMD18-T載體, 轉化TOP10擴培, 挑選陽性克隆測序獲得基因5′端序列。

1.5 CiBeclin1序列分析與系統發育樹的構建

利用ExPASy網站(http://www.expasy.org)的Translate和ProtParam程序分別進行氨基酸序列的推導和蛋白理化性質的分析, 采用SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預測蛋白的信號肽; 跨膜區預測用TMpred (https://embnet.vital-it.ch/software /TMPRED_form.html)軟件, 使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)在線分析CiBeclin1蛋白可能存在的結構域。氨基酸序列比對用ClustalW1.81軟件分析, 系統發育樹則采用Mega7.0軟件中的N-J法進行構建。

1.6 熒光定量PCR

取3尾草魚分離其肝臟、頭腎、脾臟、肝臟、腸道、心臟、胸腺、鰓、腦和肌肉組織各50—100 mg以及血液100 μL, 分別提取總RNA, 隨后取1 μg RNA逆轉錄成cDNA作為檢測CiBeclin1在不同組織中的表達。另外, 取出液氮中保存的經不同劑量MC-LR處理的對照組和實驗組草魚肝臟組織提取總RNA, 反轉錄合成cDNA, 用于分析MCLR對草魚肝臟CiBeclin1表達的影響。使用Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)方法檢測CiBeclin1的表達量, 并以草魚β-actin作為內參基因進行校正,CiBeclin1和β-actin引物見表1。qRT-PCR反應在伯樂公司CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System上完成。20 μL PCR反應體系包括5.0 μL 50倍稀釋的cDNA模板, 10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 上下游引物各0.5 μL, 4.0 μL ddH2O。反應條件: 94 ℃變性5min, 94℃ 10s, 58℃15s, 72℃ 20s 進行45個循環后, 72℃延伸5min。采用2-ΔΔCt法計算CiBeclin1基因的相對表達量。

1.7 數據分析

實驗數據均以平均值±標準差表示,CiBeclin1在不同組織中的相對表達采用One-way ANOVA分析(SPSS 16.0), MC-LR對CiBeclin1表達的影響采用多因素方差分析進行統計學檢驗(SPSS 16.0), 統計學顯著性水平設定P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 CiBeclin1基因全長cDNA序列特征分析

根據草魚轉錄組測序得到一段長約1000 bpBeclin1的序列, 隨后設計引物對該段序列進行驗證并在NCBI 上進行BLAST 分析, 進一步確定為CiBeclin1 cDNA的中間序列, 隨后通過RACE法擴增CiBeclin1基因的5′和3′末端序列。經序列拼接獲得全長序列。CiBeclin1基因全長1590 bp, 包括5′非編碼區和3′非編碼區, 分別為54 bp和192 bp, 開放閱讀框(Open reading frame, ORF)為1344 bp, 其在GenBank 上的登錄號為MG797682。對其cDNA序列進行分析, 發現該序列含有ATTAAA Ploy(A)加尾信號。對其編碼氨基酸序列預測分析, 發現CiBeclin1含有447個氨基酸, 分子量為51.2 kD, 理論等電點為4.88, 無信號肽。結構域分析表明,CiBeclin1蛋白有一個Bcl2同源結構域3(BH3, 111—120 aa)和一個進化保守結構域(ECD, 238—447 aa),并有一段不完整的富含亮氨酸的出核序列(LX3LX2LXX, 177—186 aa), 此外, 在http://smart.embl-heidelberg.de/上還預測到CiBeclin1蛋白有一個卷曲螺旋結構域(CCD, 171-211 aa)。

表1 CiBeclin1基因擴增和表達的引物Tab. 1 Primers used to amplify and express CiBeclin1 gene

2.2 CiBeclin1氨基酸同源性與系統進化分析

應用MEGA7.0軟件Neighbor-joining(NJ)法構建系統進化樹(圖1),CiBeclin1與稀有鯽的Beclin1進化關系最近, 首先聚為一小支, 之后與斑馬魚和鯉魚聚類形成一支, 再與其他魚類聚為一大支。哺乳類、兩棲類、爬行類和鳥類等其他動物聚為另一大支。

2.3 CiBeclin 1 基因組織分布特征分析

通過qRT-PCR方法研究了CiBeclin1在肝、腎、頭腎、脾、腸、心臟、鰓、肌肉、皮膚以及血液10種組織中的表達, 結果表明,CiBeclin1在所檢測的組織中均可表達, 呈組成型表達(圖2)。在肝臟中的表達量最為豐富, 其次為肌肉, 在頭腎中表達量相對較低。以相對表達量最低的頭腎作為參照進行One-way ANOVA分析, 肝臟、肌肉、腸道以及心臟中CiBeclin1的表達量顯著高于頭腎表達量(P＜0.05)。

2.4 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟CiBeclin1 mRNA水平的影響

草魚暴露于不同劑量MC-LR(25和100 μg MCLR/kg BW)不同時間后(圖3), 不同MC-LR誘導劑量對CiBeclin1 mRNA表達水平的影響差異顯著(F=170.811,P=0.000), MC-LR誘導不同時間(24h、48h、72h和96h)對CiBeclin1 mRNA水平的影響也有顯著差異(F=4.733,P=0.004); 作用濃度和作用時間之間有交互作用(F=3.967,P=0.002)。注射MCLR 24h, 48h, 72h和96h后, 2個劑量誘導組與對照組相比, 表達均顯著下調(P＜0.05); 但誘導96h 后, 100 μg MC-LR/kg BW劑量組中CiBeclin1表達量相對于誘導24h、48h和72h的表達量有上升的趨勢, 但仍顯著低于對照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 CiBeclin1基因cDNA全長的克隆及生物信息學分析

目前, 細胞自噬已成為生命科學研究領域的熱點問題。然而, 自噬相關研究在魚類中較少有報道。Beclin1作為細胞自噬的重要的調節因子, 在細胞自噬過程中發揮著重要作用[19]。本研究成功克隆了草魚CiBeclin1基因的全長cDNA序列, 其包含一個1344 bp的開放閱讀框, 編碼447個氨基酸, 含有一個BH3結構域和一個ECD結構域, 這兩個結構域在人類和哺乳類的Beclin1序列中也有[20], 對荷包紅鯉和牙鲆Beclin1結構域的研究同樣發現有這2個結構域[15—17]。與其他脊椎動物不同, 魚類Beclin1基因的BH3結構域的117位氨基酸由絲氨酸取代了甘氨酸[16]。在酵母和哺乳動物細胞中, 抗凋亡蛋白家族成員如Bcl-2以及Bcl-XL等能與Beclin1 BH3結構域處結合而抑制自噬的形成[21], 此外,Beclin1的ECD結構域與Vps34結合誘導其他自噬相關蛋白定位于該蛋白復合體參與自噬的形成[22]。推測草魚中的Beclin1可能發揮著同樣調控自噬水平的功能。除此之外,CiBeclin1蛋白還有一個預測的卷曲螺旋結構域(CCD), 位于171—211 aa, 這與稀有鯽Beclin1的報道一致[17], 然而草魚和稀有鯽CCD 結構域均由 41 個氨基酸殘基構成, 而人類的由 97 個氨基酸組成[23]。CiBeclin1經分析發現其也具有一個41個氨基酸組成的CCD結構域。另外,CiBeclin1基因沒有出核信號序列(PKKKRKV), 然而, 在177—186 aa位置有一段不完整的富含亮氨酸的出核序列(LX3LX2LXX, 其中X代表任何氨基酸),這與牙鲆和稀有鯽Beclin1的結構也相似[15], 另外, 該結構在人類和哺乳類的Beclin1序列中也有[20]。經過氨基酸同源性比對分析,CiBeclin1氨基酸序列與已報道的物種的氨基酸具有較高的相似性和一致性, 其中與稀有鯽氨基酸序列的相似性最高為98%。由以上分析可知,CiBeclin1蛋白序列和結構與其他魚類及哺乳動物都比較相似。

圖1 草魚及其他脊椎動物Beclin1基因的系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Beclin1 of grass carp and other species

圖2 CiBeclin1的組織特異性表達分析Fig. 2 Tissue-specific expression of CiBeclin1 mRNA in grass carp

圖3 MC-LR對草魚肝臟CiBeclin1表達的影響Fig. 3 The effects of MC-LR on the expression of CiBeclin1 in liver of grass carp

3.2 CiBeclin1基因在不同組織中的表達分析

已有的研究報道表明,Beclin1可在健康牙鲆腦、鰭條、心臟、肝臟、腸道、胃和腎臟組織中廣泛表達[15], 對稀有鯽Beclin1的表達分析也發現其可在不同組織中表達[17]。本研究同樣發現CiBe-clin1也在所有檢測的組織中表達, 包括肝、腎、頭腎、脾、腸、心臟、鰓、肌肉、皮膚以及血液。Beclin1在各組織中的廣泛表達提示了它在魚類中具有非常重要的作用。

3.3 MC-LR對草魚肝臟CiBeclin1 mRNA水平的影響

目前的研究報道表明細胞自噬除了在維持細胞內環境的穩態以及調節細胞的生長、分化和發育中起著重要作用外[24], 還在抵抗外界各種刺激,如饑餓、紫外線輻射、缺氧、病原體感染以及環境污染等方面起著自我保護作用[25—27]。其中有一些研究通過Beclin1的表達變化探討了自噬在機體抵御環境污染物中的影響, 如Gao 等[16]檢測了鎘暴露后荷包紅鯉腎臟組織中Beclin1基因的表達情況,結果發現在鎘暴露后, 腎臟中Beclin1 mRNA和蛋白水平都有劑量和時間依賴性的升高, 因此作者認為Beclin1在應對鎘的生物毒性上具有一定的作用。盡管MC-LR引起機體自噬的報道不多, 但有文獻報道從微囊藻中提取的MC-LR可誘導腎Vero-E6細胞內質網空泡形成, 自噬小體大量聚集[28]。在原代培養的支持細胞中, 電鏡結果顯示MC-LR能夠引起自噬小體增多, 說明MC-LR能促進自噬的發生[29]。也有研究報道Cho細胞經2.5、5和10 μmol/L MCLR處理后,Beclin1 表達升高, 且與對照組相比, 差異都有統計學意義(P＜0.05), 并通過一系列實驗證實了MC-LR誘導的自噬作為一種保護機制可抑制凋亡的發生[30]。然而, 吳珍等[9]采用qRT-PCR 分別檢測自噬相關基因Beclin1 和LC3α的轉錄水平, 結果發現, MC-LR 在上調LC3α的同時, 抑制了Beclin1 的轉錄水平, 這與本實驗結果類似。本研究通過qRT-PCR檢測到不同劑量MC-LR誘導草魚后,CiBeclin1的表達均被顯著抑制。這些結果表明Beclin1在受到MC-LR脅迫后, 其表達會產生變化, 但在今后我們還需要更多的實驗進一步驗證Beclin1在抵御MC-LR脅迫中的具體作用。