草魚在攝食高能飼料后血清生化指標的動態變化

田 娟 劉 偉 蔣 明 趙京壯 吳 凡 喻麗娟 陸 星 文 華

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223;2. 淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心, 武漢 430070; 3. 長江大學動物科學學院水產系, 荊州 434020)

動物從外界攝取營養物質的第一目的是為了供給生命活動的能量需要, 攝入的部分營養素被用于分解代謝, 以產生能量用于同化作用以及維持生命的其他過程[1]。在現代水產養殖中, 為了滿足養殖品種快速生長的需求, 通常會采取在較短時間內給予養殖對象以過高能量的營養策略。蛋白質、碳水化合物和脂質是水產動物三種主要的能量來源, 然而飼料含過高水平的蛋白質、脂肪或碳水化合物均會影響魚類的攝食和生長, 誘發多種魚類發生肝臟代謝障礙(俗稱“肝膽綜合癥”、“脂肪肝”等),導致生理狀態發生變化影響魚體的健康[2—5]。

血液是在心臟和血管腔內循環流動的一種極其重要的組織, 在機體里主要起運輸營養物質、防御和免疫、維持內環境穩定、參與體液調節等作用, 故血液指標值能反映動物的健康狀態[6]。對于魚類而言, 血液生理生化指標的變動范圍較大, 其結果受內源或外源多種因素共同作用的影響, 如年齡、性別、繁殖、食性等內源性因素和餌料、溶氧、溫度、養殖方式、疾病等外源性因子等[7,8]。在魚類營養學研究中, 發現魚類血液生化指標與機體的攝食、營養狀況、飼料組成、飼料源等密切相關[9—15], 但同時發現魚類血液指標參數并不穩定,難以通過測定血液指標得出準確的實驗結論。因此本實驗試圖測定餐后不同時間點的生化指標, 進行動態監測, 從而更準確地研究飼料組成對血液指標造成的影響。草魚(Ctenopharyngodon idella)作為我國養殖產量第一的淡水魚類, 被廣泛用于魚類營養學及營養性疾病學的研究[16—18]。本實驗以3組高能純化飼料及對照組飼料喂養草魚幼魚11周, 采取餐后4個時間點的血液樣品, 測定8種常見的與糖脂代謝相關的血液指標, 旨在研究高能量飼料對草魚血清生化指標的影響, 為準確測定魚類血液指標提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

據報道草魚幼魚飼料適宜的蛋白質、脂肪、糖含量分別為30%—35%[19]、6%—7.5%[20]、不超過33%[21], 蛋能比為19.5 mg/kJ[22]。在本實驗中, 以酪蛋白和明膠作為蛋白源, 以玉米油和大豆油(質量比1∶1)作為脂肪源, 糊精為糖源, 設計的對照組飼料(CON)中含30%的蛋白質、8%的脂肪、36%的糊精, 以滿足草魚幼魚在生長和非特異性免疫方面的需求。另外設計了3組高能飼料, 分別是高蛋白組(HP)、高脂肪組(HF)和高碳水化合物組(HC)。3組高能飼料較對照組飼料配方, 含更高的蛋白質、脂肪和碳水化合物, 其總能較對照組提高11%, 具體實驗飼料配方和營養成分如表1所示。所有原料經超微粉碎機粉碎后過孔徑0.3 mm的網,將粉料充分混勻, 最后加豆油、玉米油和25%的水進行調和, 用模孔直徑為2 mm的絞肉機擠壓成條狀, 置于50℃烘箱中烘干, 然后破碎成長度為3 mm左右的顆粒飼料, 置于-20℃冰柜中冷藏備用。

表1 實驗飼料組成和基本分析Tab. 1 Composition and proximate analysis of the experimental diets

1.2 實驗魚與飼養管理

實驗用草魚取自長江水產研究所苗種繁育場。在實驗魚運回后, 用聚維酮碘進行消毒, 然后在循環水養殖系統中暫養2周, 暫養期間以對照組飼料飼喂, 以使其適應實驗飼料和實驗環境。實驗開始前將實驗魚饑餓24h, 選取體質健壯、規格整齊、初始體質量為(55.0±2.5) g的實驗魚320尾, 用80 mg/L水的MS-222麻醉后稱重, 養殖于16個封閉式循環水養殖桶中(直徑85 cm, 水深70 cm, 水體體積約400 L), 每桶20尾, 將16個桶隨機分成4組, 每組設4個重復, 分別飼喂4種實驗飼料。根據魚體生長、攝食和水溫等環境狀況及時調整投飼量, 確保魚體搶食并盡量不出現殘餌, 每天表觀飽食投喂3次(08:30—09:00、12:30—13: 00、17:00—17:30), 投飼率3%—5%。每日記錄水溫、草魚攝食行為和死亡數量等, 每天換水1/3。養殖期間室溫(12—22)℃,水溫(25—28)℃, 溶氧質量濃度大于5 mg/L, pH 6.8—7.3, 氨氮質量濃度小于0.05 mg/L。共計飼養11周。

1.3 樣品采集

為避免多次放水撈魚又補充新水所造成的水溫差和多次捕撈操作對試驗魚造成的應激, 影響檢測結果, 本試驗采樣時進行以下操作: 在11周養殖實驗結束時, 先將每個養殖桶的試驗魚全部撈出,使用MS-222麻醉后, 從中隨機挑選8尾, 平均放入另外4個養殖桶中; 同一處理組的4個養殖桶均進行相同操作; 操作完成后每個養殖桶中養殖8尾魚, 來自原來同一處理組的4個平行, 即每個平行提供2尾,用于后續4個時間點的取樣。將實驗魚禁食48h, 確保水溫和魚體健康狀況正常, 從每組的4個養殖桶中隨機選取1個桶, 將桶中的8尾實驗魚撈出, 麻醉后置于冰盤上采用尾靜脈采血, 此次采樣被定義為對照樣本(完全饑餓狀態)。剩余的養殖桶, 用對應的處理組飼料飽食投喂1次, 然后分別在喂食后的2h、8h和24h三個時間點按上述采樣方法各采集血液1次, 將采集的血液樣品在4℃靜置5h后, 3000 r/min離心15min, 取上清貯存于-80℃冰箱中待檢測血清指標。

1.4 測定方法

每一處理組共計取血清8管, 每管取200 μL血清置于比色杯中, 然后按照希森美康全自動生化分析儀(CHEMIX-800)的操作方法進行測定, 所用試劑均購自Sysmex公司。血清甘油三酯(TAG) 、總膽固醇(TCHO) 、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)含量分別采用ADP-HK、COD-POD、CDH-UV法測定, 血清低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量采用終點法, 葡萄糖(GLU)含量采用己糖激酶法測定, 谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)分別采用門冬氨酸氨基轉移酶測試法(MDHUV)、丙氨酸氨基轉移酶測試法(LDH-UV)、對硝基苯磷酸(p-NPP)法。

1.5 數據統計與分析

所得實驗數據以平均值±標準差(Mean±SD,n=8)表示, 實驗結果用SPSS17進行統計與分析, 運用一般線性模型單變量進行雙因素分析, 采用Tukey's進行多重比較檢驗。對采樣時間點(T)和不同飼料(D)進行雙因素方差分析, 檢測了采樣時間點(T)和飼料(D)對測定指標的主要影響, 以及它們的交互作用。同一處理組在不同采樣時間點的差異用字母“x, y, z”表示, 同一采樣時間點不同處理組間的差異用字母“a, b, c, d”表示,P＜0.05即認為存在顯著性差異, 運用OriginLab 8.0軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 草魚在攝食高能飼料后血清谷草轉氨酶活性的動態變化

如圖1所示, 草魚血清AST活性受到采樣時間點和不同飼料的顯著影響(P＜0.05), 且兩者存在交互作用。草魚AST活性在餐后2h達到峰值, 且在2h時3個高能組AST活性均較對照組顯著升高(P＜0.05), 而在24h時各實驗組AST活性無顯著差異(P＞0.05)。HC和HF組AST活性隨餐后時間延長下降, 且餐后8h和24h較對照和2h差異顯著(P＜0.05)。HP組在2h時出現最大值, 8h降低到最低值, 24h恢復到初始值。

圖1 高能量飼料對草魚餐后血清谷草轉氨酶活性的影響Fig. 1 Effect of high-energy diets on postprandial AST activities in serum of grass carp

2.2 草魚在攝食高能飼料后血清谷丙轉氨酶活性的動態變化

草魚幼魚血清谷丙轉氨酶的變化如圖2所示,采樣時間點和不同飼料均顯著影響草魚血清ALT活性(P＜0.05), 且兩者對其存在交互作用。草魚ALT活性在餐后24h達到峰值, 且在24h時3個高能組ALT活性較對照組均顯著升高(P＜0.05)。CON組ALT活性在4個采樣時間點無顯著差異(P＞0.05)。HC和HF組ALT活性隨餐后時間延長而升高, 且餐后8h和24h較0和2h差異顯著(P＜0.05);HP組在24h時出現最大值, 且較其他采樣時間點顯著升高(P＜0.05)。

圖2 高能量飼料對草魚餐后血清谷丙轉氨酶活性的影響Fig. 2 Effect of high-energy diets on postprandial ALT activities in serum of grass carp

2.3 草魚在攝食高能飼料后血清堿性磷酸酶活性的動態變化

如圖3所示, 采樣時間點和不同飼料均顯著影響草魚血清ALP活性(P＜0.05), 且兩者對其存在交互作用。4個實驗組的草魚餐后血清ALP在餐后24h達到峰值, 但各組間無顯著差異(P＞0.05)。在餐后8h, 3個高能組較對照組顯著升高(P＜0.05)。HC和HP組ALP活性在4個采樣時間點無顯著差異(P＞0.05)。HF實驗組在0和2h時無顯著差異(P＞0.05), 隨后開始上升, 在8h時達到峰值, 8h和24h較0和2h顯著升高(P＜0.05)。CON組0h和24h ALP活性較2h和8h顯著升高(P＜0.05)。

圖3 高能量飼料對草魚餐后血清堿性磷酸酶活性的影響Fig. 3 Effect of high-energy diets on postprandial ALP activities in serum of grass carp

2.4 草魚在攝食高能飼料后血清膽固醇含量的動態變化

血清膽固醇含量在各實驗組的變化如圖4所示, 不同飼料顯著影響草魚血清TCHO含量(P＜0.05), 采樣時間點對其無顯著影響(P＞0.05), 但兩者對血清TCHO含量存在交互作用。4個處理組的TCHO含量無明顯的峰值時間點, CON組和HF血清TCHO含量餐后波動不明顯, 4個采樣時間點無顯著性差異(P＞0.05)。HC和HP組變化趨勢相同, 0時含量最高, 其他3個時間點較0h顯著降低(P＜0.05)。在0時, HC組和HP組較CON組和HF組顯著升高(P＜0.05); 其他3個采樣時間點, 4個處理組間無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 高能量飼料對草魚餐后血清膽固醇含量的影響Fig. 4 Effect of high-energy diets on postprandial TCHO contents in serum of grass carp

2.5 草魚在攝食高能飼料后血清高密度脂蛋白膽固醇含量的動態變化

草魚幼魚血清高密度脂蛋白膽固醇的含量變化如圖5所示, 采樣時間點和不同飼料均顯著影響草魚血清HDLC含量(P＜0.05), 且兩者對其存在交互作用。血清HDLC含量的變化與CHO相似。CON組和HF組餐后4個時間點無明顯變化。HC組和HF組,0時含量顯著高于其他3個時間點(P＜0.05)。在0h時,HC組和HP組較CON組和HF組顯著升高(P＜0.05)。

圖5 高能量飼料對草魚餐后血清高密度脂蛋白膽固醇含量的影響Fig. 5 Effect of high-energy diets on postprandial HDLC contents in serum of grass carp

2.6 草魚在攝食高能飼料后血清低密度脂蛋白膽固醇含量的動態變化

圖6 高能量飼料對草魚餐后血清低密度脂蛋白膽固醇含量的影響Fig. 6 Effect of high-energy diets on postprandial LDLC contents in serum of grass carp

如圖6所示, 采樣時間點和不同飼料均顯著影響草魚血清LDLC含量(P＜0.05), 且兩者對其存在交互作用。4個實驗組的草魚餐后血清LDLC含量在餐后24h達到峰值, 24h時HP組較對照組顯著降低(P＜0.05); 在餐后2h和8h, 4個處理組均較0h顯著降低, 且在0h時和8h時3個高能組LDLC含量均較對照組顯著升高(P＜0.05)。

2.7 草魚在攝食高能飼料后血清葡萄糖含量的動態變化

如圖7所示, 采樣時間點和不同飼料均顯著影響草魚血清GLU含量(P＜0.05), 且兩者對其存在交互作用。草魚血清GLU含量在餐后2h達到峰值。較對照組, HC組在2h時顯著升高, HF組顯著降低(P＜0.05), HP組無顯著差異(P＞0.05)。在餐后0h,3個高能組均較對照組顯著降低, 而餐后8h和24h均較對照組顯著升高(P＜0.05)。餐后8h和24h, 4個處理組內的血糖含量趨于穩定, 未出現明顯差異(P＞0.05)。

圖7 高能量飼料對草魚餐后血清葡萄糖含量的影響Fig. 7 Effect of high-energy diets on postprandial GLU contents in serum of grass carp

2.8 草魚在攝食高能飼料后血清甘油三酯含量的動態變化

血清甘油三酯含量的變化如圖8所示, 采樣時間點和不同飼料均顯著影響草魚血清TAG含量(P＜0.05), 且兩者對其存在交互作用。草魚血清TAG含量在餐后8h達到峰值。在0h, HP組較對照組顯著降低, HC組和HF組顯著升高(P＜0.05)。在2h和8h時HC和HF組TAG含量均較對照組顯著升高(P＜0.05), 而HP組無顯著差異(P＞0.05)。在24h, 4個處理組間無顯著差異(P＞0.05)。

圖8 高能量飼料對草魚餐后血清甘油三酯含量的影響Fig. 8 Effect of high-energy diets on postprandial TAG contents in serum of grass carp

3 討論

3.1 采樣時間點對草魚血清生化指標的影響

魚類血液指標被廣泛運用于評價魚體健康和營養狀況。在本實驗中, 攝食不同飼料的草魚幼魚在禁食48h后, 再重新攝食相應飼料, 除血清TCHO外, 血清AST、ALT和ALP活性, 以及血清HDLC、LDLC、GLU和TAG含量均受到采樣時間點即餐后時間的顯著影響, 且餐后時間與飼料存在交互作用;草魚血糖和血清AST活性均在餐后2h達到峰值, 血清ALT和ALP活性以及LDLC含量均在餐后24h達到峰值, 血清TAG含量在餐后8h達到峰值, 而血清TCHO和HDLC含量則無明顯峰值。在對大菱鲆(Psetta maxima)[24]和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[25]的研究中均發現, 血漿氨基酸含量與采樣時間顯著相關。奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×O.aureus)血漿AST和ALT活性同樣受到采樣時間點的影響[26]。在吉富羅非魚(GIFT,Oreochromis niloticus)、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)、軍曹魚(Rachycentron canadum)中均發現, 魚類血糖在餐后1—3h達到峰值, 且高糖組的血糖含量較低糖組顯著升高[12]。在飼喂羅非魚中、高脂肪水平飼料后, 血糖峰值出現在6h, 血清TAG峰值出現在餐后12h, 而TCHO的峰值受到飼料脂肪水平的影響[27]; 在另一個對羅非魚的研究中發現, 在注射葡萄糖后血漿TAG水平快速上升, 在3h后達到峰值[12]。這些結果均表明魚類攝食后, 營養物質在體內進行吸收、消化、代謝后,部分血液生化指標會迅速升高, 達到某個峰值, 然后下降; 峰值的高低與飼料組成有關, 也暗示部分血液指標隨采樣時間點的不同出現動態變化, 且餐后時間與飼料存在交互作用, 這提示研究者在進行魚類血液指標檢測時, 需要保證不同處理組的采樣時間同步性, 即均在餐后同一時間點采樣, 否則將因采樣時間點的不同出現假陽性差異。

3.2 高能量飼料對草魚血清生化指標的影響

在已有的對魚類血液學的研究報道中, 通常檢測饑餓24h的魚體血液生化指標, 因此為了所討論的結果具有可比性, 此部分僅討論本研究的24h實驗結果。血清AST和ALT活性是反應肝功能的靈敏指標[28]。在本實驗中, 3個高能組ALT活性顯著高于對照組, 而AST活性在餐后24h, 4個處理組間無顯著差異。郭小澤等在草魚上研究發現攝食高脂飼料(飼料脂肪含量8.2%)后, 血清AST和ALT活性較對照組(飼料脂肪含量3.1%)無顯著差異[10]; 而汪開毓等[29]研究發現高脂組(飼料脂肪含量8.1%)草魚血清中AST、ALT活性極顯著高于對照組(飼料脂肪含量4.6%), 羅非魚中亦得到類似結果[11]; 在羅非魚幼魚上亦發現血清中AST和ALT活性隨飼料碳水化合物水平的升高而升高(飼料能量隨碳水化合物水平的升高而升高)[30,31], 高糖飼料亦顯著提高了草魚這2種轉氨酶活性[10]; 但高蛋白飼料不影響星斑川鰈幼魚(Platichthys stellatus, Pallas 1788)血漿這2種轉氨酶活性[32]。這說明對于不同魚類高水平的脂肪和碳水化合物可能均會導致血清轉氨酶活性的升高, 對草魚肝功能造成一定損傷, 但損傷程度與飼料配方和養殖對象有關。

ALP活性與機體的營養免疫狀態有關, 是體內的一種解毒酶。在正常情況下, 血清中ALP活性較低, 當肝臟或骨骼發生病變時, 血清中ALP酶活性會升高[33]。在本實驗中, 餐后24h, 4個處理組的草魚幼魚血清ALP活性無顯著差異。同樣在草魚上的研究發現高脂飼料不影響血清ALP活性, 但高糖飼料顯著提高了ALP活性[10]; 繆凌鴻等[34]在研究中發現高碳水化合物水平飼料對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)血漿ALP活性無顯著影響; 而隨著飼料中脂肪含量的增加, 羅非魚血漿中ALP活性逐漸升高[11]; 高蛋白飼料同樣不影響星斑川鰈幼魚血漿ALP活性[32]。這些結果的差異, 可能與機體的免疫狀態有關, 需要通過測免疫指標進一步闡述其機理。

葡萄糖為機體各組織行使生理功能提供能源,魚類血糖濃度受到飲食、應激、氣候、藥物等的影響, 并受神經、內分泌激素等調節[7]。同時魚類對糖的耐受性較差, 在攝食后, 會迅速出現高血糖現象。在本實驗中, 餐后2h血糖濃度達到峰值。餐后24h, 3個高能組的血糖含量顯著高于對照組。研究者報道高碳水化合物飼料會導致羅非魚、卵形鯧鲹、軍曹魚、翹嘴紅鲌(Erythroculter ilishaeformisBleeker)、南方鲇幼魚(Silurus meridionalisChen)和厚唇弱棘?(Hephaestus fuliginosus)等血糖濃度升高[12,35—37]。高脂飼料亦會導致羅非魚[38]、黃姑魚(Nibea albifloraRichardson)[39]血糖濃度升高。這些結果說明魚類血糖濃度的升高可能是為了快速代謝所攝入的過多糖或脂肪。

魚類血脂(包括TAG、TCHO、HDLC和LDLC等)水平的變化與機體的新陳代謝、生理狀況密切相關, 被廣泛地用來評價魚體的脂肪代謝能力。在本實驗中, 餐后24h, 血清TAG、TCHO和HDLC含量4個處理組間均無顯著差異, 僅HP組血清LDLC含量較對照組顯著降低。郭小澤等[10]發現高糖和高脂飼料均會顯著提高血清TAG和TCHO含量; 汪開毓等[29]研究發現高脂組草魚血清TAG和TCHO的含量均顯著高于低脂組。同時在長期攝食高糖或者高脂飼料后, 羅非魚餐后24h血清TAG和TCHO含量均較對照組顯著升高[12,27,31]。前人的研究報告, 總體上得出高糖或高脂飼料會提高魚體血液中TAG和TCHO含量, 這些結果與本實驗在24h的結果存在差異, 但TAG結果與本實驗在8h的結果一致。本文認為這可能與魚類本身的消化吸收能力和代謝速率有關, 草魚的腸道排空時間為12h[40], 羅非魚為18h[41], 而大部分肉食性或雜食性魚類的胃腸排空時間超過24h, 如大西洋鮭(Salmo salarL.)餐后24h腸道仍然存在少量內容物,餐后48h才開始消化完畢[42], 虹鱒為28—29h[43]。這也進一步說明在進行魚類血液生化指標分析時, 需要考慮水產動物的血液指標受到多種因素的影響,其在發生動態變化, 因此, 為了得出更準確的結論,一方面需要用其他指標對血液生化指標所得出的結論進一步進行驗證, 另一方面應考慮不同魚本身的代謝特性。

4 結論

草魚血清生化指標受到餐后采樣時間點和飼料的顯著影響, 為確保實驗結果的準確性, 需要保證不同處理組的采樣時間同步性, 即均在餐后同一時間點采樣, 同時需要用其他指標對血液生化指標所得出的結論進一步進行驗證。