銅鎘聯合脅迫處理對鯽體內重金屬和組織病理的影響

涂葉綠 沙小梅 龐娟娟 劉 俊 邵艷紅 王振興 李 鑫

(1. 江西師范大學地理與環境學院, 南昌 330022; 2. 江西師范大學國家大宗淡水魚加工技術研發分中心, 南昌 330022;3. 江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心, 南昌 330022)

重金屬污染是指由重金屬或其化合物造成的環境污染, 近年來已成為全球性的環境問題[1]。重金屬污染主要因為工業上廢水、廢渣和廢氣的排放, 農業上化肥、殺蟲劑等的使用, 以及生活污水的排放和廢棄物的堆放等, 對環境造成嚴重的影響[2]。重金屬污染一部分表現在土壤中, 給土壤生態系統帶來不利影響[3,4]; 另一部分則表現在水體中, 對水生生物的健康產生危害, 進而以食物鏈的形式傳遞到人體, 對人體健康產生威脅[5—7]。

銅(Cu)和鎘(Cd)是常見的重金屬污染物, 對魚類的生理活動有重要影響[8]。對于魚類而言, 銅是其新陳代謝所需的元素之一, 但濃度過高后將在魚體富集進而對其造成較大程度的損害, 增加鰓的滲透壓和氧化應激, 影響其神經系統等[9,10]。鎘是一種非典型過渡性金屬, 對于生物而言是非必需金屬,能夠對魚類的個體發育、成活率等產生不利影響,引起肝臟等組織器官發生病變[11]。水體環境中的重金屬銅和鎘不僅能在魚體內富集, 而且會對魚體各組織產生病理損傷, 影響其健康生長。單丹等[12]研究表明, 羅非魚的各組織均能富集銅, 但不同組織對銅的富集能力不同, 其中肝臟組織的富集量最高。Guardiola等[13]研究了水體中不同鎘濃度和暴露時間對金頭鯛體內鎘富集程度和組織病理變化的影響。目前, 在銅和鎘對魚體的影響方面, 主要研究集中在兩方面: 一是檢測多種重金屬元素(含銅和鎘)在魚體內的富集情況及食用安全性[14,15];二是通過暴露實驗模擬研究銅或鎘對魚體毒性效應、組織病理學等方面的影響[16,17]。人為進行銅鎘聯合脅迫對魚體影響的相關報道較少。Jiang等[18]研究了單一的和聯合的銅鎘對鯉熱休克蛋白的影響, Driessnack等[19]研究了水體銅和鎘對黑頭呆魚各組織重金屬富集和繁殖能力的影響, 趙巖[20]研究了銅、鎘和鉻對孔雀魚的單一與聯合毒性效應。目前, 尚未發現有關銅鎘水體聯合暴露對鯽各組織重金屬蓄積和病理影響的系統報道。以鯽為對象,研究聯合脅迫處理下銅鎘在其體內的富集及對機體各組織病理的影響, 能反映銅鎘對鯽生長健康狀況的影響, 對我國鯽的食用安全性評估有著重要的意義。

鯽(Carassius auratus), 是我國重要的食用經濟魚類之一, 屬于我國大宗淡水魚范疇, 其產量位居淡水魚前列。據統計, 2016年, 我國鯽年產量在各淡水魚品種中位居第5, 達3×109kg, 比2015年增長3.19%[21]。鯽肉質鮮美, 營養豐富, 深受廣大消費者的歡迎和喜愛[22]。課題組前期以鯽為對象, 分別研究了銅和鎘對鯽各組織蓄積情況和組織病理的影響, 發現銅和鎘均能在鯽體內富集并對機體各組織產生病理損傷。

因此, 基于當前研究現狀和前期研究基礎, 本文以鯽為研究對象, 采用實驗室模擬半靜態法, 人為添加銅和鎘在水體環境中, 研究聯合脅迫下銅和鎘在鯽體內的蓄積情況, 進一步通過組織病理學研究銅鎘聯合脅迫對鯽組織器官的影響, 為綜合研究銅鎘污染對鯽健康狀況的影響提供理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用鯽為異育銀鯽, 源于江西省南昌市某養殖場; 銅標準品和鎘標準品來自于國家標準物質研究中心; 魚飼料, 購自通威股份有限公司南昌分公司; 五水合硫酸銅和氯化鎘均為分析純, 分別購自西隴化工股份有限公司和天津市大茂化學試劑廠。

1.2 方法

銅鎘聯合脅迫處理鯽用半靜態水體暴露法, 將鯽在曝氣3d的清水中馴養14d。在馴養期間,每天喂食2次, 每次投放飼料量為魚體重的1%。在馴養結束后, 調整水體的Cu2+濃度分別為0、0.01、0.05、0.10和0.15 mg/L, Cd2+濃度依次為0、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/L。為避免因魚體吸收導致水體重金屬濃度下降, 每天更換三分之一的重金屬溶液并采用虹吸法除去異育銀鯽的代謝產物和雜余餌料。Cu和Cd聯合脅迫處理14d后將鯽解剖, 取出肝臟、鰓絲、肌肉和腸道, 置于-80℃冰箱備用。

鯽中銅和鎘含量的檢測參照涂宗財等[23],采用混合酸(HNO3∶HClO4=9∶1)消解樣品, 加熱除去剩余的混合酸、定容后, 用原子吸收光譜法檢測銅和鎘含量。

鯽的組織病理研究病理檢測參考鄭婷婷等[24], 將樣品固定在4%的多聚甲醛中24h, 常規梯度乙醇脫水, 石蠟包埋, 采用病理切片機(RM2016型, 上海徠卡儀器)進行切片, 石蠟切片厚4 μm,HE染色, 中性樹膠封片, 顯微鏡(Nikon Eclipse CI,日本尼康)觀察并放大200倍拍照記錄。

2 結果

2.1 重金屬銅鎘在鯽體內的富集分析

圖1為重金屬銅鎘聯合脅迫處理14d后鯽肝臟、鰓絲、腸道和肌肉中銅、鎘含量分布圖。與對照組(未添加銅、鎘)相比, 銅鎘聯合脅迫能顯著提高鯽肝臟、鰓絲、腸道和肌肉中銅和鎘的含量,表明鯽各組織器官均能富集水體環境中的重金屬銅和鎘。

在銅鎘聯合脅迫下, 隨著水體環境中鎘含量的增加(從0.05 增加至0.20 mg/L), 鯽肝臟、鰓絲、腸道和肌肉中鎘的含量呈上升趨勢。其中, 鰓絲對鎘的富集效果最為明顯, 當高濃度銅鎘聯合脅迫處理鯽14d后, 其鰓絲中鎘含量達到了0.42 mg/kg。與鯽體內鎘含量的變化趨勢相反, 隨著水體環境中銅含量的增加(從0.01 增加至0.15 mg/L), 鯽肝臟、鰓絲、腸道和肌肉中重金屬銅的含量整體呈現下降的趨勢。

2.2 在銅鎘聯合脅迫下鯽肝臟的組織病理變化

如圖2所示, 未添加銅鎘的空白組鯽肝臟組織切片見圖2a, 肝細胞呈多角狀, 細胞界限清晰, 結構完整, 排列緊密, 細胞質染色較淺, 細胞核染色較深且基本位于細胞中央位置。在0.01 mg/L銅和0.05 mg/L鎘聯合脅迫處理鯽后, 其肝細胞界限仍然清晰可見, 結構較為完整, 但觀察到了血細胞聚集現象(圖2b)。當銅鎘濃度分別增加到0.05和0.10 mg/L時, 部分肝細胞已被損傷, 肝臟組織中聚集的血細胞明顯增多, 還出現了脂沉積(圖2c)。當銅鎘濃度分別達到0.10和0.15 mg/L時, 鯽肝臟組織不僅表現出血細胞聚合和脂沉積, 而且部分肝細胞呈現了空泡化現象(圖2d)。在0.15 mg/L銅和0.20 mg/L鎘聯合脅迫處理鯽后, 鯽肝細胞形狀不規則且大小不一,血細胞聚集和脂沉積已隨處可見。此外, 細胞空泡化程度明顯增強, 表明鯽肝細胞已受到嚴重損傷。

2.3 在銅鎘聯合脅迫下鯽鰓絲的組織病理變化

圖1 銅鎘聯合脅迫處理后鯽不同組織中銅、鎘的含量Fig. 1 The concentrations of Cu and Cd in different tissues after combined treatment

圖2 銅鎘聯合脅迫處理后鯽肝臟的病理圖Fig. 2 Liver histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

如圖3所示, 未脅迫處理的鯽, 其鰓絲結構清晰完整, 鰓小片長短均一、排列整齊(圖3a)。在0.01 mg/L銅和0.05 mg/L鎘聯合脅迫處理鯽后, 鯽鰓絲結構清晰可見, 然而鰓小片基部上皮細胞輕微增生, 黏膜腫脹(圖3b)。當銅鎘濃度增加到0.05和0.10 mg/L后, 鯽鰓小片上皮細胞增生明顯加重, 并伴隨著充血的癥狀(圖3c)。當水環境中銅鎘濃度分別為0.10和0.15 mg/L時, 鰓組織出現鰓小片上皮細胞水腫、增生、黏膜腫脹等癥狀, 甚至部分鰓小片已難以辨識(圖3d)。當銅鎘濃度進一步提高, 分別達到0.15和0.20 mg/L時, 鰓絲組織除上皮細胞水腫、增生之外, 還表現出鰓小片結構消失、脫落溶解的癥狀(圖3e)。

圖3 銅鎘聯合脅迫處理后鯽鰓絲的病理圖Fig. 3 Gill histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

圖4 銅鎘聯合脅迫處理后鯽腸道的病理圖Fig. 4 Gut histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

2.4 在銅鎘聯合脅迫下鯽腸道的組織病理變化

如圖4所示, 未脅迫處理的鯽, 其腸道組織未見明顯的病理損傷, 腸道絨毛形態完整, 腸上皮細胞排列整齊(圖4a)。在0.01 mg/L銅和0.05 mg/L鎘聯合脅迫處理鯽后, 腸道組織雖結構清晰完整, 但杯狀細胞出現了腫脹現象(圖4b)。而在0.05 mg/L銅和0.10 mg/L鎘聯合脅迫處理鯽后, 其腸道組織杯狀細胞腫脹明顯加重, 固有層出現液泡, 柱狀細胞增生(圖4c)。當水環境中銅鎘濃度分別達到0.10和0.15 mg/L后, 觀察到鯽腸道組織不僅出現固有層液泡, 而且伴隨有腸黏膜糜爛、腸絨毛斷裂等現象(圖4d)。當水環境中銅鎘濃度分別為0.15和0.20 mg/L時, 鯽腸道組織結構較為模糊, 柱狀細胞增生顯著,固有層出現液泡, 腸黏膜糜爛, 且腸絨毛脫落壞死(圖4e)。

2.5 在銅鎘聯合脅迫下鯽肌肉的組織病理變化

從圖5a可以看出, 未脅迫處理的鯽, 其肌纖維呈多邊形, 結構完整有序。然而, 在0.01 mg/L銅和0.05 mg/L鎘聯合脅迫處理鯽后, 其肌纖維的結構遭到破壞, 出現彎曲、斷裂的現象(圖5b)。增加銅鎘濃度分別到0.05和0.10 mg/L, 此時鯽的肌纖維已明顯斷裂, 且纖維間隙變寬(圖5c)。銅鎘濃度繼續增加到0.10和0.15 mg/L后, 鯽的肌纖維斷裂, 肌肉細胞聚集, 同時纖維間隙寬度增大(圖5d)。當水環境中銅鎘濃度分別達到0.15和0.20 mg/L時, 鯽的肌纖維斷裂、肌肉細胞聚集, 還呈現出肌纖維溶解崩潰的癥狀(圖5e)。

3 討論

3.1 重金屬銅鎘在鯽體內的富集及食用安全性

鯽肌肉重金屬含量是判斷其食用安全性的重要評價指標, 我國行業標準《NY 5073-2006 無公害食品水產品中有毒有害物質限量》中明確規定魚類含鎘量不能超過0.10 mg/kg[25]。在本文的銅鎘聯合脅迫實驗中, 銅濃度設置為0.01—0.15 mg/L,鎘濃度設定為0.05—0.20 mg/L。當0.15 mg/L銅聯合0.20 mg/L鎘脅迫處理鯽14d后, 其肌肉中鎘含量達到了0.13 mg/kg, 超過了我國的行業標準閾值。但鯽肌肉中銅含量最大值為3.23 mg/kg, 遠小于標準中魚類銅含量(≤ 50 mg/kg)的限定。此外, 本文中鯽生存的水環境中銅濃度(0.01—0.15 mg/L)低于鎘濃度(0.05—0.20 mg/L), 但在鯽的肝臟、鰓絲、腸道和肌肉中, 銅含量顯著高于鎘, 即銅在鯽體內的蓄積效果比鎘明顯。原因可能是, 銅在生物體內作為獨特的催化劑, 不僅參與造血過程中銅和鐵的代謝, 還參與一些酶和黑色素的合成[26]。因此, 必需元素銅比非必需元素鎘更易于魚體主動吸收, 繼而在鯽各組織中富集程度更高。

圖5 銅鎘聯合脅迫處理后鯽肌肉的病理圖Fig. 5 Muscle histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

3.2 重金屬銅鎘對鯽各部位組織病理的影響

在銅鎘聯合脅迫下, 隨著水體環境中銅含量的增加, 鯽各部位(肝臟、鰓絲、腸道和肌肉)中銅的含量整體呈下降趨勢, 可能是因為魚體同時對銅和鎘進行富集, 鎘抑制了機體對銅的吸收, 這與吳東軍等[27]的報道相似, 鎘可以抑制魚類胃和腸對銅和鋅的吸收。在鯽的各部位中, 肝臟對銅的富集效果最明顯, 當0.01 mg/L銅聯合0.05 mg/L鎘脅迫處理鯽14d后, 其肝臟中銅含量達到了4.95 mg/kg。這與馬莉芳[9]的研究結果一致, 其研究結果表明, 在黃河鯉的各組織中, 肝臟對銅的蓄積效果最為顯著。肝臟既是動物體的解毒器官, 又能夠通過抗氧化系統酶活力的誘導實施自我保護, 借助相關代謝酶活性的抑制而使代謝物積累在肝臟[23,28—31]。

肝臟具有解毒和防御功能, 是魚類維持生命活動和代謝的實質性組織器官[23,29,30]。在一般情況下, 水環境中的重金屬(如銅、鎘等)由鰓絲攝入魚體, 再經血液循環達到肝臟等器官, 當積累的重金屬濃度超出肝臟的解毒能力, 將會損傷肝細胞、影響其微觀結構[32—34]。在本文中, 銅鎘聯合脅迫處理鯽后, 其肝組織出現了血細胞聚集、脂沉積、細胞空化等癥狀, 說明銅鎘聯合處理損傷了鯽的肝組織。此外, 除重金屬之外, 其他污染物亦會對鯽的肝組織產生不良影響。課題組前期研究表明, 水體中的磺胺嘧啶對鯽的肝臟組織具有較強的毒害作用, 致使其發生不同程度的病理變化, 其中包括肝細胞淤血、空泡化、核固縮、細胞溶解壞死等[24]。

鰓是魚類的呼吸器官, 在呼吸過程中與外界水環境直接接觸, 容易受水環境中污染物的影響, 造成鰓組織的病理損傷[24]。在本文中, 銅鎘聯合脅迫對鯽鰓組織的影響主要表現為上皮細胞增生、水腫、黏膜腫脹, 以及鰓小片脫落溶解等。污染物影響和損傷魚鰓組織形態變化的反應有兩種: 一種是防御反應, 即使得魚鰓產生炎癥, 表現出上皮細胞腫大、鰓小片隆起等; 另一種是污染物直接損傷,表現出上皮細胞壞死脫落, 鰓結構破壞等[24,35,36]。基于本文中銅鎘聯合脅迫對鯽鰓組織造成的損傷現象, 推測低濃度的銅鎘聯合脅迫引起了鯽鰓組織的防御反應, 而后期高濃度的銅鎘聯合脅迫則給鯽鰓組織造成了直接損傷, 出現了鰓小片脫落、溶解等現象。

腸道是魚類對營養物質消化和吸收的重要場所, 腸道組織發生病變易影響營養物的消化吸收,造成魚類營養不良、生產滯緩[24]。同時, 作為魚類的重要免疫器官之一, 腸道的損傷易增加其患病風險[37]。在本文中, 銅鎘聯合脅迫處理鯽使其腸道杯狀細胞腫脹、柱狀細胞增生、固有層出現液泡、腸黏膜糜爛、腸絨毛脫落壞死等, 表明銅鎘損傷了鯽的腸道組織, 對吸收營養物質和抵御外界環境造成不利影響。腸道的健康狀態也可通過腸道微生態的變化來反映。課題組前期結果表明, 水體污染物(包括抗生素、重金屬等)會改變鯽腸道微生物組成, 降低鯽腸道微生物的多樣性, 對鯽的健康有著較大威脅[24,38]。

鯽肌肉不僅能供人類食用以補充蛋白質, 而且對魚體自身而言還承擔著運動功能。因此, 鯽肌肉組織的病變損傷一方面會影響其食用品質和安全性, 另一方面將降低鯽的運動能力和生存本領。在本文中, 銅鎘聯合脅迫處理鯽能導致其肌纖維斷裂、聚集、崩潰、溶解, 同時伴隨著肌纖維間隙變寬, 實驗結果也表明鯽肌肉組織遭到嚴重損傷, 影響其生長和食用特性。除重金屬之外, 其他水體污染物也會對魚類的肌肉組織造成不良影響。鄭婷婷等[24]研究顯示磺胺嘧啶會促使鯽肌肉組織發生病變, 主要表現為肌纖維排列疏松、紊亂和斷裂。此外, 陳秀榮等[39]研究結果表明, 氰戊菊酯會損傷草魚肌肉組織, 使草魚肌纖維排列紊亂和松散, 且表現出明顯的運動不協調性。

銅和鎘均能在魚體內富集, 并對魚體各組織產生病理損傷[40]。任洪濤等[41]研究了Cr6+對草魚肝臟組織結構的影響, 結果表明, Cr6+使得草魚肝細胞肥大, 無序性離散程度增大, 細胞核縮小, 出現細胞空化等現象。聶志娟等[42]研究發現, 高濃度的銅能對刀鱭幼魚鰓造成嚴重損傷, 使其上皮細胞腫大、毛細管充血、鰓小片脫落。在本文中, 隨著水體中銅鎘濃度的增加, 鯽各組織(肝臟、鰓絲、腸道和肌肉)中鎘含量呈上升趨勢, 銅含量呈下降趨勢, 且各組織病理損傷程度明顯加重。鎘進入魚體內, 在肝臟與硫蛋白結合生成絡合物, 影響機體對銅的吸收[27], 使得機體各組織中銅含量下降。因此, 有理由推測, 銅鎘聯合脅迫處理鯽過程中, 鎘在鯽各組織病理損傷中發揮了主導作用。這與本文中銅鎘對鯽食用安全性的影響結果相一致。隨著水體中銅和鎘含量的增加, 鯽肌肉中的鎘含量超出了食用標準的閾值, 而銅含量始終在安全食用范圍內。

綜上所述, 本文研究了水體中銅鎘聯合脅迫對鯽各組織(肝臟、鰓絲、腸道和肌肉)銅鎘的蓄積能力及其病理的影響。水體中的銅和鎘均能在鯽各組織中富集, 隨著水體中銅和鎘濃度的增加, 魚體各組織銅鎘含量呈相反趨勢, 即銅含量下降、鎘含量上升, 主要原因是重金屬鎘抑制了鯽對銅的吸收。當水體中銅和鎘濃度分別為0.15 和0.20 mg/L,聯合脅迫處理鯽14d后, 其肌肉中鎘含量超出了行業標準的閾值。銅鎘聯合脅迫處理鯽后, 其各組織均受到不同程度的病理損傷, 且銅鎘濃度越高、損傷程度越大, 主要是由于機體內鎘濃度的升高所導致。上述結果表明, 在自然環境中, 尤其是銅鎘含量較高的水域, 需特別關注鎘對鯽的生長健康狀況和食用安全性帶來的不利影響。