細胞餅瞬時表達體系的優(yōu)化

韓 娟，繆國鵬，張科貴，汪承潤，王順昌

（淮南師范學院，安徽淮南2320385）

當前，臨床使用的重組蛋白類藥物大多數(shù)來自于哺乳動物細胞和大腸桿菌表達生產(chǎn)平臺，少部分來自酵母和昆蟲細胞。但這些常用的表達系統(tǒng)有其明顯的缺陷，主要表現(xiàn)為高生產(chǎn)成本、低效率、低產(chǎn)率。另外，哺乳動物作為主要的真核表達系統(tǒng)，還涉及到病原菌污染等嚴重安全性問題。這就需要一種高表達、經(jīng)濟實用、安全性高的新的表達系統(tǒng)來生產(chǎn)這些重組蛋白[1]。與哺乳動物細胞類似，植物細胞同樣擁有內(nèi)膜系統(tǒng)，因此可以利用分子伴侶折疊和組裝重組蛋白。而與動物表達系統(tǒng)相比，植物表達系統(tǒng)有若干優(yōu)勢，如缺少動物病原性的污染物、價格低廉及便于擴大性生產(chǎn)等[2]。

作為生物反應器來生產(chǎn)外源蛋白的植物生產(chǎn)平臺，可以是轉基因植株，也可以是懸浮培養(yǎng)細胞，可以是永久表達，也可以是瞬時表達，每一種系統(tǒng)各有優(yōu)缺點[3]。轉基因植物的細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白的方法集合了完整植株培養(yǎng)和微生物發(fā)酵、動物細胞培養(yǎng)的很多優(yōu)點。懸浮細胞既能像微生物一樣能在廉價的培養(yǎng)基上生長，生物量倍增時間短；又能像動物細胞培養(yǎng)一樣合成較復雜的多聚體蛋白和糖蛋白，如免疫球蛋白等。同時，植物懸浮培養(yǎng)細胞與轉基因植株一樣能進行蛋白質(zhì)的正確加工、修飾、折疊等，不攜帶人類病原菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，容易規(guī)模化放大。更為重要的是，細胞懸浮培養(yǎng)在人工控制的條件下進行，并使用與傳統(tǒng)微生物和哺乳動物細胞培養(yǎng)類似的生物反應器，一方面不存在基因漂移等環(huán)境安全問題，另一方面容易通過GMP認證[4]。正因如此，第一個成功注冊的植物源藥用蛋白（Elelyso?）就是以植物細胞培養(yǎng)作為平臺的。

然而，穩(wěn)定轉化的懸浮細胞中重組蛋白的產(chǎn)量往往較低。因此，研究人員對懸浮細胞的瞬時表達技術進行過較為系統(tǒng)的研究。真空滲漏法（Agroinfiltration）通過機械法促進農(nóng)桿菌深入植物葉肉細胞間隙，是當前植株瞬時表達領域應用最為廣泛的技術[5-6]，然而卻無法用于懸浮細胞。在植物雙元表達載體中引入病毒相關蛋白實現(xiàn)的Magnifection技術由于依賴胞間連絲實現(xiàn)胞間轉染，而懸浮細胞的胞間連絲基本處于退化和斷裂的狀態(tài)[7]，因此也不適用于懸浮細胞。近期，Sukenik等將農(nóng)桿菌直接加入至植物懸浮細胞培養(yǎng)體系中，并通過優(yōu)化參數(shù)得到了瞬時轉化效率的一定提升，然而所感興趣的重組蛋白的總產(chǎn)量僅十幾毫克每升[8]。

細胞餅（Cell pack）是通過控制真空度對懸浮細胞進行抽濾后得到的具有一定空隙的餅狀細胞團塊。在這種細胞餅上進行瞬時轉化時具有與農(nóng)桿菌更多的接觸面積，進而具有較高的轉化效率[9]。這一技術在工業(yè)化生產(chǎn)中還可通過抽濾使細胞形成柱狀、層狀等再進行轉基因操作，具有極大的研究價值。為增強煙草、擬南芥以及生菜等植株的瞬時轉化效率，前人對真空度、真空持續(xù)時間，農(nóng)桿菌類型、濃度[10-11]，以及光照、濕度、表面活性劑類型等[12-13]進行了優(yōu)化。然而，針對細胞餅瞬時轉化技術的優(yōu)化研究卻未見報道。

本研究旨在通過對細胞餅瞬時轉化技術進行優(yōu)化，以指導后續(xù)可能的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

農(nóng)桿菌：根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

植物材料：煙草BY-2細胞。

主要試劑：鏈霉素、卡那霉素、利福平、辛硫酸、半胱氨酸、Silwet L-77、Triton X-100、乙酰丁香酮、鹽酸。

1.2 載體構建

實驗室前期構建得到植物雙元表達載體pYBA1132-35S-T載體，其具有eGFP表達盒以及為目的基因插入所準備的多克隆位點。載體經(jīng)Bam-HI和HindIII雙酶切后，通過同源重組與合成的人重組蛋白白介素10（hIL10）基因進行連接，得到重組載體pYBA1132-IL10-EGFP（圖1）。

圖1 本研究所用植物雙元表達載體pYBA1132-IL10-EGFP圖譜

1.3 細胞餅制備

將布氏漏斗與真空泵連接成抽濾裝置。在超凈工作臺內(nèi)，將剪成合適大小的濾紙放置于布氏漏斗上，務必覆蓋住全部空隙，開啟真空泵。將煙草懸浮細胞倒入布氏漏斗中，抽濾1分鐘，再將抽濾好的細胞餅倒扣在玻璃培養(yǎng)皿中。為消除抽濾操作帶來的誤差，將每個細胞餅切成均等的四份（圖2），并分別進行稱重。每種處理及對照設置四個重復。

圖2 細胞餅制備以及處理

1.4 瞬時轉化

重組質(zhì)粒經(jīng)熱擊法轉化根癌農(nóng)桿菌LBA4404后，利用卡那霉素、鏈霉素和利福平篩選陽性克隆并進行驗證。挑取陽性克隆培養(yǎng)后凍存。取復蘇的農(nóng)桿菌以2%接種量接種至250 mL YEB培養(yǎng)基中，置于150 rpm、28℃的搖床上培養(yǎng)至OD值為0.5或1.0。離心收集菌體，用加有100 μM乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基重懸。為探討抗氧化劑與表面活性劑對轉化效率的影響，分別在上述菌液中加入不同濃度或類型的抗氧化劑以及表面活性劑。對于半胱氨酸，菌液中分別加入終濃度為0.1 g/L和0.5 g/L的半胱氨酸（0.1 M鹽酸配制100 g/L母液），以溶劑0.1 M鹽酸為對照，另設不加菌液的陰性對照。辛硫酸用乙醇配制為100 mM母液，處理濃度為10 μM和100 μM，乙醇做對照，另設不加菌液的陰性對照。表面活性劑選取兩種，即Silwet L-77以及Triton X-100，加入菌液中的終濃度為0.01%或0.05%（v/v）。每克細胞餅用0.55 mL菌液或對照溶劑浸潤，將培養(yǎng)皿放入28℃，85%相對濕度的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天或5天。

1.5 蛋白提取與含量測定

在特定時間收獲煙草細胞，以1 mL/g向細胞中加入蛋白提取液（加有5 mM EDTA以及5 mM β-巰基乙醇的pH 7.4磷酸緩沖液）進行研磨與蛋白提取。離心得到蛋白提取液進行GFP熒光強度的測定。GFP熒光強度測定在酶標儀中進行（Hitachi Model F-2500,Japan），488 nm激發(fā)并測定509 nm發(fā)射光強度。用未加菌樣品的熒光信號做背景扣除，外標法定量。

采用蛋白質(zhì)印跡對IL10進行定性，一抗選用兔抗人IL10單克隆抗體（Cat:10947-R001，Sino Biological，China），二抗選用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體（A0208，碧云天，中國）。IL10的定量反應參照ELISA試劑盒說明書進行（Cat:KIT10947A，Sino Biological，China）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)表示為4個重復的平均值。利用SPSS軟件（IBM，美國）計算標準差以及進行方差分析。置信水平設置為95%或99%。

2 結果

2.1 農(nóng)桿菌菌液濃度與培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

本研究采用了兩種菌液濃度，OD值分別為0.5和1.0，其對應的菌體濃度約為0.5×109以及1.0×109cfu/mL。實驗結果表明，隨初始菌液濃度以及共培養(yǎng)時間的增加，GFP的含量也隨之增加。在OD值為1.0時，處理5天后GFP的含量達到最大值，16.78±1.21 μg/g FW（圖3）。然而，當培養(yǎng)至7天時，局部的細胞餅出現(xiàn)了褐化死亡，因此未對指標進行測定。選取菌液濃度為OD 1.0，培養(yǎng)時間為5天進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖3 農(nóng)桿菌菌液濃度以及培養(yǎng)時間對細胞餅瞬時轉化生產(chǎn)GFP的影響

2.2 抗氧化劑對轉化效率的影響

為探討抗氧化劑對細胞餅轉化效率的影響，本研究選取了半胱氨酸和硫辛酸兩種試劑。半胱氨酸的添加對轉化效率的影響與濃度相關：低濃度的半胱氨酸（0.1 g/L）對轉化效率有一定的提升作用，然而高濃度（0.5 g/L）卻表現(xiàn)出微弱的抑制作用。使用低濃度半胱氨酸使GFP含量提升至18.38±1.55 μg/g FW（圖4）。值得注意的是，由于溶解半胱氨酸的溶劑酸性較大，實驗發(fā)現(xiàn)，對照溶劑對GFP的含量同樣具有一定的抑制作用，雖然在統(tǒng)計學上并不顯著。硫辛酸添加對GFP產(chǎn)量的影響與半胱氨酸類似，但效果較半胱氨酸更好。低濃度的辛硫酸（10 μM）處理5天后，GFP的產(chǎn)量達到24.51±2.04 μg/g FW（圖4）。

2.3 表面活性劑對轉化效率的影響

如圖5所示，表面活性劑Silwet L-77以及Triton X-100均可以在不同程度上提高瞬時轉化的效率，且提升的效果隨表面活性劑的濃度的提升而增加。其中，添加0.05%的Silwet L-77使得GFP的含量提升至最高的35.66±2.57 μg/g FW，是對照的2.13倍。

圖4 不同類型抗氧化劑對細胞餅瞬時轉化生產(chǎn)GFP的影響

圖5 不同類型與濃度的表面活性劑對細胞餅瞬時轉化生產(chǎn)GFP的影響

2.4 優(yōu)化條件下細胞餅中IL-10的產(chǎn)量

為進一步檢測上述優(yōu)化條件的優(yōu)劣，我們測試了重組蛋白質(zhì)藥物rIL-10的產(chǎn)量。WB結果顯示，抗體在21.9 kDa處檢測出標準rIL10蛋白，而在細胞提取物中，抗體則在35～45 kDa之間的膜上有明顯結合（圖6）。由于rIL10蛋白在煙草中常以二聚體形式表達[14]，因此，上述實驗結果證實轉基因煙草BY-2細胞中確已表達有rIL10蛋白。Marker中意外發(fā)現(xiàn)有顯影條帶，原因可能與其內(nèi)含有的預染色蛋白質(zhì)標準有關。ELISA結果表明，rIL10重組蛋白的產(chǎn)量可達到39.37±4.28 μg/g FW，是對照的3.66倍。

圖6 WB驗證細胞餅中rIL10蛋白的表達

3 討論

細胞餅制備與轉化使懸浮細胞的瞬時轉化得以實現(xiàn)，這對于后期工業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義[15]。然而關于這一體系的參數(shù)優(yōu)化研究尚屬空白。

細胞餅技術的發(fā)明人Thomas Rademacher在其專利中對細胞餅制備的工藝參數(shù)，如真空抽濾時間、細胞餅含水量、環(huán)境濕度等進行了優(yōu)化[9]。由于影響瞬時轉化還有諸多因素，我們選取了非常重要的菌液濃度以及添加物進行研究。

農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化過程中較易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象[16]，而對于細胞餅來說，這種褐化情況可能更容易發(fā)生。研究表明，在轉化過程中加入還原性物質(zhì)，如L-半胱氨酸、硫辛酸、聚乙烯吡咯烷酮、抗壞血酸等可減少褐化的產(chǎn)生，同時提升轉化效率[16-17]。Wroblewski等[18]在優(yōu)化擬南芥、生菜以及番茄的瞬時轉化效率時發(fā)現(xiàn),高于25 mM的半胱氨酸反而對轉化效率具有抑制效果。本研究所用半胱氨酸的濃度分別是0.83 mM以及4.13 mM，均低于前述研究，然而高濃度仍抑制了轉化效率。這可能是因為懸浮細胞所形成的細胞餅與葉片細胞在形態(tài)、生長狀態(tài)等諸多方面存在差異，進而使得半胱氨酸的作用性質(zhì)發(fā)生了變化。對于硫辛酸，其原理應也半胱氨酸類似。

表面活性劑可以幫助農(nóng)桿菌浸潤和黏附于植物葉片，因此在植株瞬時轉化中被廣泛證實具有促進轉化效率的作用[19-20]。本研究中，兩種測試的表面活性劑，Triton X-100以及Silwet L-77均具有促進轉化的作用，而Silwet L-77的作用更為突出。通過在菌液中加入0.1%的Silwet L-77，Hahn等[20]發(fā)現(xiàn)去掉真空處理亦可達到90%的葉面轉化率。本實驗所用的最高濃度只為Hahn等的一半，是否更高濃度具有更優(yōu)良的效果仍有待進一步研究。

為進一步提升細胞餅瞬時轉化技術的應用前景，本研究初步探究了農(nóng)桿菌濃度、抗氧化劑以及表面活性劑對轉化效率的影響，為后續(xù)這一技術的應用奠定了一定的理論基礎。