異型雄性羅氏沼蝦遺傳多樣性的微衛星分析

呂 敏，黃光華，李 旻，楊 瓊，盧小花，甘 暉，阮志德，黃立斌，楊彥豪，盧天和，馬華威

(1.廣西壯族自治區水產科學研究院，廣西壯族自治區水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西 南寧 530021； 2.廣西壯族自治區水產畜牧學校，廣西 南寧 530021 )

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是一種大型淡水蝦，因其適水范圍廣、易養殖、肉質嫩滑、商業價值高等特點逐漸成為我國、東南亞乃至全世界重要的水產養殖品種。日益增長的羅氏沼蝦產量難以滿足逐漸上升的消費和市場需求，需進一步突破產量的限制因素以提高羅氏沼蝦產額。由于雄蝦較雌蝦生長快、成熟個頭大、養殖產出量高[1]，因此，在苗種培育和養殖中解決導致性別和個體差異的機制是提高產量的關鍵。

已有研究發現，3種不同形態的雄性羅氏沼蝦各具有不同規格的范疇[1]。幼體雄蝦基于相對生長率分別被劃分為“跳躍生長”和“滯后生長”兩種類型[2]，經60 d變態發育，前者個體比后者大15倍[3]，并且變態發育成藍色或橙色長臂的大個體雄性，后者發育成小個體雄性[4]。這3種不同形態型的雄蝦雖然屬于相同發育時期，但在行為、生理、形狀上不同，并且其形態差異特征隨著發育而逐漸顯著，所以這3類形態型代表了其動態發育過程的不同階段，每尾雄蝦都可能通過橙色長臂形態型自小個體蛻變成藍色長臂形態型[5-6]。蝦個體形態差異受遺傳和環境影響，但形態遺傳是性別二態性狀，雌性形態顯著可控(h2≈5)，雄性形態遺傳不可控[7]。

關于羅氏沼蝦遺傳多樣性已有諸多研究，如朱其建等[8]研究了羅氏沼蝦抗病選育群體的遺傳多樣性，陳雪峰等[9]研究了人工養殖與選育對羅氏沼蝦遺傳多樣性的影響，孫成飛等[10]采用微衛星分析法研究了羅氏沼蝦6個養殖群體遺傳多樣性，蔣欽楊等[11-12]對羅氏沼蝦不同地理群體的遺傳多樣和變異情況進行了研究，甘西等[13]開展了羅氏沼蝦遺傳多樣性的RAPD研究，Divu等[14]分離出了羅氏沼蝦微衛星，并進行了遺傳多樣性分析，Chareontawee等[15]對泰國養殖的羅氏沼蝦的遺傳多樣性進行了研究，Liu等[16]研究了不同羅氏沼蝦種群遺傳多樣性分析。不同形態型雄蝦的產生有以下原因：(1)遺傳差異、變態年齡等個體內在因素[17-18]；(2)空間和資源受限等環境因素引起競爭[19]；(3)種群地位等級、領地等種群內部社會因素[20]。近些年來，微衛星現代分子標記技術雖未能發現細微遺傳差異[8,16]，但因其能解決等位酶技術而廣泛用于生物育種和遺傳研究，具有多態性高、共顯性遺傳、重復性高和易檢測等優點。目前，羅氏沼蝦自主或者人為的長期近親交配導致了種質退化，迫切要求對其進行鑒定區分，再加上羅氏沼蝦雄性形態遺傳不可控，造成了父本遺傳差異精確性評估不足，嚴重影響了良種選育，因此利用微衛星標記技術摸清近親交配形態型雄蝦的個體生長遺傳多樣性有助于解決該現實問題。本研究基于羅氏沼蝦藍色長臂型、橙色長臂型、小個體型3種不同形態型的近親交配雄蝦群體，利用8個微衛星位點研究其遺傳多樣性，旨在為其良種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗蝦為廣西種群近親交配成年雄性羅氏沼蝦，200尾，由國家級(南寧)羅氏沼蝦良種場提供，于良種場中心實驗室5 m×5 m×1.8 m養殖池中養殖4個月。基于顏色、行為、生長特征及鋸齒狀螯，將試驗蝦分為藍色長臂型、橙色長臂型、小個體型3種形態型雄蝦[21-24]。每種形態型蝦50尾，共收集150尾，藍色長臂型、橙色長臂型、小個體型體質量分別為(14.48±1.05) g、(10.04±1.15) g、(5.86±0.66) g。

1.2 DNA提取

羅氏沼蝦腹部肌肉組織基因組DNA提取按照Wizard基因組DNA純化試劑盒(美國Promega公司)步驟提取，利用紫外分光光度計測定提取液在260 nm和280 nm的吸光值(OD)，依據OD260 nm/OD280 nm比率測定DNA含量和純度，用雙蒸液定容1∶40后至-20 ℃保存。

1.3 PCR擴增

PCR反應液制備，共50 μL：10.0 μL 5×PCR buffer，5.0 μL MgCl2(2.5 mmol/L)，1.0 μL dNTP (0.2 mmol/L)，2.0 μL上下游引物(0.4 μmol/L)，24.75 μL無菌 ddH2O，0.25 μL Taq聚合酶，2.0 μL DNA模板，滅菌去離子水補齊。DNA微衛星引物設計參照文獻[15]的方法(表1)。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；按照95 ℃變性30 s進行40個循環，每對引物的實際退火溫度為48～60 ℃，反應30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸40 s，4 ℃保溫。PCR擴增產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結束后，紅色凝膠染紅，紫外顯色。然后采用聚丙烯酰胺電泳評價PCR產物數，反應液加入含有1×Tris-硼酸(TBE)緩沖液的凝膠體系，在75 V條件下泳動8 min，然后凝膠成像系統(美國AlphaInnotech公司)下觀察，以20 bp擴展DNA梯型(美國Linza公司)為參考標準目測法觀察等位基因分型和大小。

表1 羅氏沼蝦8個微衛星位點的特性

注：F：正向，R：反向.

1.4 數據分析

記錄每尾雄蝦的等位基因數、等位基因復制數、觀察雜合度、期望雜合度、基于哈代—溫伯格平衡定律的精確偏差值，并利用ARLEQUIN 3.11分析微衛星位點差異[26]。遺傳分化程度采用F統計分析，如種群等位基因頻率參數[群體內近交系數FIS、總群體近交系數FIT、群體間分化系數FST)]，參照文獻[27]方法計算基因流(Nm)[Nm=FST×0.25(1-FST)/FST×FIS]。用對基因Nei系數法測定基因間距，基于非加權配對算數平均法利用POPGEN 1.32軟件構建系統樹圖[28]。

2 結果與分析

2.1 種群遺傳多樣性

由表2可知，除小個體型的SUGbp8-109a位點外，其他位點遺傳信息呈多態性，所有統計分析中要移除該位點。3種形態型的雄蝦種群顯示高度遺傳差異，藍色長臂型、橙色長臂型、小個體型的等位基因數分別為2.985、3.782和2.827，觀察雜合度分別為0.556、0.474和0.475。哈代—溫伯格平衡定律的精確偏差值(P)采用Markov鏈方法評估，隨后被Bonferroni多重假設試驗校正。除了橙色長臂型的SUGbp8-109a、SUGbp8-109c、SUGocc28-17d位點以外，其他位點顯著偏移。

表2 3種形態型雄性羅氏沼蝦8個衛星位點遺傳多樣性

注：G.基因拷貝數，A.等位基因數，Ho.觀察雜合度，He.期望雜合度，P.哈代—溫伯格平衡定律偏差值.—.無多態性，**.非常顯著，++.不顯著.

2.2 樣本遺傳分化和關系

樣本群體間遺傳分化系數平均值為0.2877，說明樣本分化呈現顯著差異(表3)。樣本基因流平均值為0.7452，SUGbp8-109d位點基因流最大，為1.1074，SUGbp8-109a位點基因流最小，為0.2044。全部樣本的總群體近交系數和群體內近交系數值呈顯著差異(P<0.05)。由表4可知，最大基因距離位于藍色長臂型和小個體型，為1.0369，最小基因距離位于藍色長臂型和橙色長臂型，為0.7497。

表3 3種形態型雄性羅氏沼蝦8個微衛星位點F統計值

表4 3種形態型雄性羅氏沼蝦8個微衛星位點Nei數據的基因間距

3 討 論

3.1 種群遺傳多樣性

微衛星分子標記技術作為一種最有效率的中性分子標記工具廣泛應用于水產養殖領域[25,29-30]。目前，國內外學者采用微衛星分子標記技術對羅氏沼蝦遺傳多樣性進行了研究[8,15,29]，但主要研究不同種群的遺傳多樣性，對自然或者人工近親交配獲得的同性別間遺傳信息獲知較少。本研究中，以8個易識別、高度多態的羅氏沼蝦微衛星位點為標準，研究3個近親雄蝦組遺傳結構。結果顯示，除了小個體型的SUGbp8-109a位點，所有微衛星位點均顯示高度差異性；另外，藍色長臂型、橙色長臂型、小個體型分別含有24、28、22個不同等位基因，表明3組雄蝦中的等位基因具有較高的多樣性和豐度。利用6個微衛星位點研究野生羅氏沼蝦群體遺傳多樣性發現，每個位點的平均等位基因數呈高度多樣性[14]，然而，僅通過每個微衛星標記位點的等位基因數獲取該種基因多樣性有限[32]。

基因雜合度又稱基因多樣性，是指示基因差異的最佳參數[33]。由試驗結果可知，所有采樣組中觀察雜合度平均值低于期望雜合度平均值，表明雄性羅氏沼蝦的雜合度下降。3組樣品中的觀察雜合度平均值為0.474～0.556，與已報道的羅氏沼蝦野生種和繁殖種一致[14-15,31]。

3.2 樣本遺傳分化和關系

群體內近交系數表示基因隨機配對的偏差程度，其值為正表示雜合具有顯著不足，值為負表示存在過量雜合體。本研究中群體內近交系數為-0.0189，表示雜合體過剩，且過剩數量較少。除SUGocc28-17a，SUGocc28-17c、SUGbp3-5a位點外，所有位點的群體內近交系數值均為負數，說明這些位點具有過量的雜合體，可能是無效等位基因、基因分型錯誤、近親繁殖或Wahlund效應造成的[34]。

卡方(χ2)和似然率(G2)用于檢驗基因位點上顯著偏離(P<0.05)哈代—溫伯格平衡定律的群體。本研究中，除了橙色長臂型的3個基因位點外，所有基因位點與哈代—溫伯格平衡定律存在偏離，可能是由于無效等位基因的存在。通過對斑節對蝦(Penaeusmonodon)[35-37]及泰國羅氏沼蝦繁殖種群[15]遺傳多樣性的研究發現，基因分型誤差也可能造成基因位點與哈代—溫伯格平衡定律偏離；本研究結果可能與基因分型誤差也有關系。小個體型中的SUGbp8-109a基因位點是無效等位基因，研究中要注意刪除該位點以精確評價近親交配和減少基因多樣性喪失。另外，3組樣品的基因間距為0.7497～1.0369，說明8個微衛星標記具有極高差異性，表明環境對樣品組間遺傳變異的影響呈同域分布性。藍色長臂型與小個體型數值最大，說明兩者基因間距最大；藍色長臂型與橙色長臂型基因間距小，表明兩者遺傳上相近或同源。

3.3 近親交配影響異型雄性的遺傳多樣性

近年來，對不同國家或區域的羅氏沼蝦養殖種群和野生種群的基因多樣性進行了研究[14-16]。本研究基于同一種群近親交配基礎上，選取3種不同形態型雄蝦開展遺傳多樣性研究，并且未知造成3種形態型差異的專一位點基因，這種差異可能是由于遺傳等基因因素、食源和生存空間等環境因素，以及自身內部群體因素等所致。雄性羅氏沼蝦的顯著差異不僅表現在能說明其遺傳可能性的形態上，還體現在肝指數和生化特征上[38]。研究結果顯示，經4個月養殖后，藍色長臂型平均體質量為(23.34±1.26) g，橙色長臂型平均體質量為(18.39±1.37) g，小個體型平均體質量為(9.06±0.53) g，分別占研究樣本群體的21%、62.5%、16.5%。因此，其存在形態學、解剖學和生理學上的差異[24,39]。

微衛星分子標記在羅氏沼蝦群體遺傳多樣性研究中應用較多[40-43]，而對近親交配雄蝦的遺傳信息未見報道，由于雄性羅氏沼蝦在遺傳形態上不可控，研究其遺傳多樣性能為父本選育提供遺傳信息，提高苗種質量。由以上討論可知，通過近親交配的3種形態型雄性羅氏沼蝦存在遺傳差異，這種遺傳差異存在于形態和生理上，因此，本研究結果可為羅氏沼蝦優質父本選育提供基礎性遺傳信息，同時也對調控雄性羅氏沼蝦遺傳發育具有一定意義。