3種蝦肝腸胞蟲PCR檢測方法的應用比較分析

葉 鍵，許 婷，施禮科，陳 凡，王 力，陳 喆，章秋虎，郭水榮

(1.杭州市水產技術推廣總站，浙江 杭州 310017； 2.紹興文理學院，浙江 紹興 312000 )

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)屬微孢子蟲科、腸胞蟲屬，是一種可感染多種真核生物的專性細胞內寄生蟲。該病原最早于2004年作為一種未知微孢子蟲在泰國生長緩慢的斑節對蝦(Penaeusmonodon)肝胰腺小管上皮細胞內被發現[1]，2009年在斑節對蝦的肝胰腺內也發現了這種微孢子蟲[2]。蝦肝腸胞蟲對世界各地的對蝦養殖已造成不同程度的損害，泰國、越南、印度、印度尼西亞和馬來西亞等地區養殖的斑節對蝦、紅額角對蝦(P.stylirostris)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)均有該寄生蟲病發生的報道[2-8]，我國廣西[9]、浙江[10-11]、江蘇[12]、天津[13]、遼寧[14]等地亦有該寄生蟲檢出的報道。目前普遍認為，養殖對蝦生長遲緩與蝦肝腸胞蟲相關[13-16]，但患病對蝦并未停止攝食，空耗飼料、水電和人工等，由此造成的損失遠大于對蝦死亡。除垂直傳播外，蝦肝腸胞蟲還可水平傳播，包括經口攝食傳播[7]，或直接通過養殖水體在對蝦中進行傳播[17]。因其生物學特性，至今尚未找到能殺滅或是控制其發展的有效藥物。因此，快速檢測及診斷技術的建立，是從源頭防控該病原感染的關鍵。

蝦肝腸胞蟲蟲體較小，光學顯微鏡常規鏡檢難以發現，使用分子生物學技術手段是目前可行的且具備靈敏、特異、快速等特點的檢測方法。針對蝦肝腸胞蟲檢測的PCR方法主要有18S-PCR法[5]、SSU-PCR法[2]和SWP-PCR法[20]，其中后兩種檢測方法為套式PCR方法，目前業內對使用哪種方法尚無定論，考慮到特異性，諸多學者更傾向于使用SWP-PCR法。為比較3種方法在生產中的檢測效果，筆者采集不同來源的36個凡納濱對蝦苗種樣本、5個鹵蟲(Artemia)樣本及12個水體樣本，分別進行檢測驗證，旨在為蝦肝腸胞蟲的實際檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Premix ExTaq，PCR產物純化試劑盒購自TaKaRa公司(日本)，DNA抽提試劑盒購自Qiagen公司(德國)；引物合成于上海生工，具體序列見表1。36個凡納濱對蝦苗種樣本采集于杭州地區24個凡納濱對蝦淡化苗種場不同生產批次，標記為樣本1～36，5個鹵蟲樣本采集于杭州市凡納濱對蝦主養區5位養殖戶所購商品化冰凍成體鹵蟲，標記為樣本L1～L5，12個水樣采集于杭州市凡納濱對蝦主養區外蕩河道12個地理位點，標記為樣本S1～S12。

1.2 DNA的提取

凡納濱對蝦苗種取全蝦，鹵蟲取全蟲，水樣經10 000 r/min離心1 min后取沉淀，按Qiagen試劑盒操作方法提取DNA，用50 μL滅菌雙蒸水洗脫。

表1 引物列表

1.3 PCR檢測

于PCR反應管中，加入2×Premix Ex Taq 25 μL，滅菌雙蒸水19 μL，DNA模板4 μL，和上下游引物(濃度25 μmol/L)各1 μL，混勻離心后置于PCR儀上，參照文獻[2,5,20]中描述的方法分別對目的片段進行擴增。

1.4 產物測序

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果，切取陽性片段，用PCR產物純化試劑盒回收后，交TaKaRa公司克隆測序，將所得序列通過美國國立生物技術信息中心的BLAST檢索系統進行同源性分析。

2 結 果

2.1 擴增結果

36個凡納濱對蝦苗種樣本檢測結果見圖1，5個鹵蟲樣本及12個水樣檢測結果見圖2。18S-PCR檢測陽性樣本為5和L5；SSU-PCR第一步擴增陽性樣本為L5，第二步擴增陽性樣本為1、2、3、4、5、7、15、24、29、30、33、34、35、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S6、S7和S11；SWP-PCR第一步擴增陽性樣本為L5，第二步擴增陽性樣本為1、2、5、15、29、33、35、L5、S2和S11。

2.2 陽性產物測序結果

陽性產物測序所獲得序列長度及BLAST結果見表2。18S-PCR及SWP-PCR陽性產物測序結果均正確。SSU-PCR在凡納濱對蝦樣本檢測中獲得的陽性產物測序結果正確；L3號鹵蟲樣本陽性產物序列長度為167 bp，BLAST匹配結果為一種非蝦肝腸胞蟲的微孢子蟲，S1和S3號水樣陽性產物序列長度為175 bp，BLAST匹配結果為一種非蝦肝腸胞蟲的微孢子蟲，其余陽性產物測序結果均正確。

圖1 36個凡納濱對蝦苗種樣本檢測結果a:18S-PCR；b:SSU-PCR第一步擴增；c:SSU-PCR第二步擴增；d:SWP-PCR 第一步擴增；e:SWP-PCR第二步擴增；N:陰性對照；P:陽性對照；M: DNA marker.

圖2 5個鹵蟲樣本及12個水樣檢測結果a:L1～L5號鹵蟲樣本18S-PCR；b:S1～S12號水樣18S-PCR；c:L1～L5號鹵蟲樣本SSU-PCR第一步擴增；d:S1～S12號水樣SSU-PCR第一步擴增；e: L1～L5號鹵蟲樣本SSU-PCR第二步擴增；f:S1～S12號水樣SSU-PCR第二步擴增；g:L1～L5號鹵蟲樣本SWP-PCR第一步擴增；h:S1～S12號水樣SWP-PCR第一步擴增； i:L1～L5號鹵蟲樣本SWP-PCR第二步擴增；j:S1～S12號水樣SWP-PCR第二步擴增；N:陰性對照；P:陽性對照；M:DNA marker.

2.3 檢測結果比較

綜合以上結果，針對這52個樣本的蝦肝腸胞蟲檢測，18S-PCR檢測的陽性率為3.77%，SSU-PCR檢測的陽性率為32.7%，SWP-PCR檢測的陽性率為18.86%。18S-PCR在一步擴增的靈敏度最好，在凡納濱對蝦苗種5號樣本中獲得陽性條帶，而其他兩種方法均未見條帶。在第二步擴增上，SSU-PCR的靈敏度顯著高于SWP-PCR，但在檢測鹵蟲樣本時會出現167 bp的假陽性條帶，在檢測水樣時會出現175 bp的假陽性條帶；在靈敏度不及SSU-PCR的情況下，SWP-PCR擴增的特異性較好，未出現假陽性條帶。

表2 陽性條帶測序長度及BLAST比對結果

3 討 論

3.1 不同檢測方法的靈敏度差異

在凡納濱對蝦苗種的檢測中，能否最大限度辨別出陽性苗種最為關鍵，也最受關注，直接影響到養殖生產的成敗。目前已報道的檢測方法主要包括顯微觀察法、普通PCR檢測法、實時熒光定量PCR法[10,15]、地高辛標記核酸探針原位雜交法[5]和LAMP法[18]。不同的檢測方法在靈敏度上存在著一定的差異。LAMP法和TaqMan實時熒光定量PCR法[10]靈敏度為套式PCR的10倍。SYBR Green實時熒光定量PCR法[15]靈敏度為套式PCR的4倍。在套式PCR檢測到蝦肝腸胞蟲的樣品中，只有第一步PCR反應呈陽性的樣品，才能在肝胰腺組織中用光學顯微鏡觀察到可辨識的孢子[6]。考慮到檢測時限、高通量檢測成本、水產養殖基層實驗室設備、結果可靠性等因素，普通PCR方法仍然是目前生產領域最為實用的檢測技術。

Jaroenlak等[19]根據孢壁蛋白SWP序列設計引物，建立了套式SWP-PCR檢測技術，發現SWP-PCR的第一步擴增靈敏度比SSU-PCR高100倍，在第二步擴增上，兩者的靈敏度無顯著差異。但通過實際檢測發現，在未知樣本的檢測上，SSU-PCR第二步擴增的靈敏度要顯著高于SWP-PCR，并且只有SSU-PCR第二步擴增條帶相對較亮的樣本，SWP-PCR第二步擴增才能獲得相應條帶。可能產生這種結果的原因為，其以標準陽性質粒為模板進行了比對試驗，在實際檢測中，還存在目的序列的基因豐度差異，這種差異往往直接影響了實際檢測的靈敏度。由于凡納濱對蝦苗種中蝦肝腸胞蟲的攜帶量較低，往往要依靠套式PCR的第二步擴增才能檢出，因此SSU-PCR更適合苗種中蝦肝腸胞蟲的檢測。

3.2 SSU-PCR假陽性條帶對實際檢測的影響

已有報道表明，SSU-PCR應用于魚粉等原料的檢測時，會出現假陽性反應，同時在檢測蟹類樣品時，也會出現假陽性反應，并且假陽性條帶的位置與目的條帶的位置不易區分[19]。筆者在檢測中也發現，SSU-PCR在第二步擴增上確實存在著一些假陽性現象，鹵蟲中檢出的假陽性物種為其他種的微孢子蟲，水中檢出的假陽性條帶為一種寄生搖蚊的微孢子蟲[20]。由于目前未報道養殖對蝦可被這些產生交叉反應的物種感染，因此針對對蝦的蝦肝腸胞蟲檢測，SSU-PCR仍是可信任的方法。

凡納濱對蝦取樣時，往往體表會留有一定量的水，這些水中可能存在的上述假陽性物種是否會對檢測結果有干擾，筆者認為其可能性也不大。由于在檢測的過程中對水樣進行檢測時首先要進行離心，可以視為一定程度上的濃縮，才能在套式PCR的第二步擴增中觀察到條帶，而凡納濱對蝦苗種取樣后，一般會加一定量的95%乙醇保存，這是對殘留水的一次稀釋，之后實際檢測中會剔除這部分乙醇，這又是一次稀釋，即便是未能完全剔除，其含量也可忽略不計，通過套式PCR的方法也已檢測不到。有鑒于此，在針對凡納濱對蝦苗種進行蝦肝腸胞蟲的檢測時，推薦采用靈敏度更高SSU-PCR的方法；在針對餌料生物、環境樣本等進行蝦肝腸胞蟲的檢測時，推薦采用特異性更好的SWP-PCR方法。

3.3 蝦肝腸胞蟲的多種攜帶渠道值得引起高度重視

已有研究表明，在海水[9]、感染塘池水及冰凍鹵蟲[5]中均能不同程度檢測到蝦肝腸胞蟲的存在；通過檢測也發現，市售商品化冰凍鹵蟲和凡納濱對蝦主養區周邊水域中均能檢測到蝦肝腸胞蟲，這與已有的報道吻合。鹵蟲為凡納濱對蝦養殖過程中的重要動物性餌料，而對蝦的養殖用水大多取自周邊的主要河道，同時凡納濱對蝦苗種階段蝦肝腸胞蟲的攜帶率又較高，種種因素表明，凡納濱對蝦的養殖暴露在蝦肝腸胞蟲存在的大環境下，面臨著較大的系統性風險，對其防控存在著較大難度，相關從業者要引起高度重視，從生產的各個環節嚴格把控，以確保養殖生產的成功。