黑骨藤對坐骨神經損傷大鼠的保護作用*

王 恒，吉楊丹，王燕林，黨榮敏，余躍生，沈祥春

(1.黔南民族醫學高等專科學校，貴州都勻 558003；2.貴州醫科大學天然藥物資源優效利用重點實驗室，貴陽 550025)

周圍神經損傷(peripheral nerve injury，PNJ)是臨床上的常見疾病，其發生與周圍神經干或其分支受到外界直接或間接力量作用損傷有關，因具有病程長、損害大、治療困難等特點[1]，受損后的神經修復與再生過程復雜，目前西藥治療PNJ療效局限[2]。民族藥中含有的治療PNJ藥物，因其具有療效確切、不良反應小、多靶點作用等優點，近年來倍受國內外學者關注。黑骨藤為蘿藦科，杠柳屬植物黑龍骨的干燥根或全株，具有活絡、通經、祛風、解毒等藥效。苗族藥名為蛙莽塞，是貴州苗族地區民間廣泛用于閉合性軟組織損傷、風濕與類風濕等疾病的民族藥，有“萬藤之王”之美譽[3]。本課題組的前期研究發現，黑骨藤具有抗急性痛風作用及修復線蟲因熱刺激引起的神經損傷，對神經疼痛治療和修復神經損傷有一定療效[4-5]。因此本研究建立大鼠坐骨神經夾持損傷模型，檢測黑骨藤對大鼠坐骨神經功能指數(sciatic functional index，SFI)及大鼠血清中炎性細胞因子表達的影響，探討黑骨藤對坐骨神經損傷(sciatic nerve injury，SNI)的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康清潔級SD大鼠120只，雄性，體質量280～320 g，由貴州醫科大學動物實驗中心提供。動物合格證號SCXK(黔) 2012-0001。實驗前置于室溫18～22 ℃，相對濕度65%，光照周期12 h，適應性喂養3 d。

1.1.2主要儀器與設備 R-210型旋轉蒸器購自瑞士BUCHI公司，電爐、電熱恒溫水浴鍋購自上海越進醫療器械一廠，DZF-4型真空干燥箱購自上海醫用恒溫設備廠，TDL-4ZB型臺式低速離心機購自湖南星科科學儀器廠，DG530酶聯免疫檢測儀購自華東電子集團醫療裝備有限公司，KJ-210A型振蕩器購自姜堰康健醫療器具有限公司，TS-100型搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，BS223型電子天平購自北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.1.3藥物與試劑 黑骨藤飲片購于貴州同濟堂制藥有限公司(由貴州醫科大學龍慶德副教授鑒定為西南杠柳黑骨藤的全株)，70%乙醇提取，提取率1.45%。白細胞介素(IL)-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒批號為201611，均為武漢基因美生物科技有限公司產品。

1.2方法

1.2.1SNI模型建立及給藥 120只SD大鼠分為4組，分別為假手術組(A組)、模型組(B組)、黑骨藤10 mg/kg組(C組)、黑骨藤20 mg/kg組(D組)，每組30只。B、C、D組大鼠均行SNI手術：10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定于手術板(俯臥位)。消毒右股后部皮膚，剪刀剪一縱行切口(約1 cm)，暴露并游離坐骨神經。在脛神經和腓總神經分離處用止血鉗夾閉(30 s)，造成神經擠壓傷。用11-0無損傷縫線，固定于神經外膜作為標記。此時大鼠小腿及足完全癱瘓，展爪反射完全消失，則示造模成功[6]。A組暴露并游離坐骨神經但不夾閉，縫合皮膚。術后C、D組大鼠每天分別給予10、20 mg/kg黑骨藤乙醇提取物灌胃，A、B組均用等體積的生理鹽水灌胃，灌胃容積均為20 mL/kg。各組均在術后第7、14、28天取材，每次10只。4組大鼠均用適量青霉素粉劑置傷口內預防感染。

1.2.2SFI測定[7]自制行走箱通道(長42.00 cm、寬14.35 cm)，等長、等寬白紙鋪于箱底，通道遠端放一鼠籠。將大鼠雙后肢蘸取碳素墨水，置于行走箱入口，大鼠在爬行過程中，每側后肢各留下4～5個足印，選擇印跡清晰足印，分別測量正常足(normal,N)及傷側足(experiment,E)的3個指標：(1)足印長度(print length，PL)，足尖到足跟的最大距離；(2)足趾寬度(toe spread,TS)，第1趾到第5趾的距離；(3)中間足趾寬度(intermediary toe spread,IT)，第2趾到第4趾的距離，結果精確到0.10 mm。將上述數據代入Bain公式，測得SFI(SFI=0為正常，SFI=-100為完全損傷)。SFI計算公式如下：SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT-8.8]

1.2.3血清制備及指標測量 股總動脈取血，離心(3 000 r/min，10 min) 取血清，分裝，置-20 ℃冰箱保存備用。ELISA檢測IL-1、IL-6、TNF-α水平，均嚴格按說明書操作。

1.2.4大鼠坐骨神經形態學觀察 股總動脈取血后解剖大鼠，取無損傷縫線標記處遠側端坐骨神經(約0.60 cm)，4%甲醛溶液固定備用。常規石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察，拍照記錄。

2 結 果

2.1各組大鼠坐骨神經病理形態學比較 A組：術后第7天神經纖維組織結構基本正常，大部分軸索大小形態正常排列規則，個別輕度腫脹；大部分髓鞘結構清楚，個別輕度變性；施萬細胞形態數量分布正常；神經束膜個別炎細胞浸潤。第14、28天神經纖維組織結構基本正常，軸索大小形態正常排列規則，髓鞘結構清楚，施萬細胞形態數量分布正常。B組：術后第7天神經纖維輕度排列紊亂，中度軸索腫脹，輕度髓鞘變性，施萬細胞中度減少，神經束膜輕度炎癥細胞浸潤。第14、28天神經纖維重度排列紊亂，重度軸索腫脹及脫失，重度髓鞘變性及脫失，施萬細胞重度減少，神經束膜輕度炎癥細胞浸潤；且在第28天時有中度纖維組織增生。C、D組：術后第7天時神經纖維輕度排列紊亂，輕度軸索腫脹，輕度髓鞘變性，施萬細胞輕度減少，神經束膜輕度炎癥細胞浸潤。第14天時C、D組大鼠神經纖維輕度排列紊亂，C組大鼠中度軸索腫脹、中度髓鞘變性、施萬細胞中度減少，D組大鼠輕度軸索腫脹、輕度髓鞘變性、施萬細胞輕度減少，兩組神經束膜均為輕度炎癥細胞浸潤。C組第28天時神經纖維輕度排列紊亂，輕度軸索腫脹及脫失，輕度髓鞘變性及脫失，施萬細胞輕度減少，神經束膜輕度炎癥細胞浸潤，輕度纖維組織增生；D組第28天神經纖維組織結構基本正常，大部分軸索大小形態正常排列規則，個別輕度腫脹；大部分髓鞘結構清楚，個別輕度變性；施萬細胞形態數量分布正常；神經束膜個別炎癥細胞浸潤，見圖1。

圖1各組大鼠術后各時間點坐骨神經的病理組織學檢查(HE，×200)

2.2各組大鼠術后各時間點SFI比較 與A組比較，B組各時間點SFI明顯降低(P<0.01)，證實模型復制成功。C、D組SFI與同時間點B組比較升高，但術后7 d差異無統計學意義(P>0.05)；C組術后28 d明顯升高(P<0.01)，D組術后14、28 d出現明顯增高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠SFI比較

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較

2.3各組大鼠術后各時間點血清IL-1水平比較 與A組比較，B組術后7、14、28 d血清IL-1水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組血清IL-1水平明顯降低(P<0.05)，C組血清IL-1水平有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4各組大鼠術后各時間點血清IL-6水平比較 與A組比較，B組術后7、14、28 d血清IL-6水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組大鼠血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)，C組大鼠IL-6有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.5各組大鼠術后各時間點血清TNF-α水平比較 與A組比較，B組術后7、14、28 d血清TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組大鼠術后7、14、28 d血清TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，C組除術后28 d血清TNF-α水平降低差異有統計學意義(P<0.05)外，術后7、14 d的血清TNF-α水平雖有所降低，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表2 各組大鼠術后各時間點血清IL-1水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

表3 各組大鼠術后各時間點血清IL-6水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

表4 各組大鼠術后各時間點血清TNF-α水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

3 討 論

SFI是對神經功能進行量化評價的客觀指標[8]。神經損傷對SFI的影響繼發于踝關節跖屈，腳趾屈肌和足內在因素的損傷，足跡的特征表現為大鼠印跡長度增加，腳趾展開的減少以及中腳趾展開減少[9]。對SFI的分析已被證明是評估SNI和修復后功能的可靠、可重復、經濟且能定量的方法，通過對SFI的測量，可以直接反映SNI后的運動神經功能[10]。本研究結果顯示，B組較A組SFI明顯降低(P<0.01)，證實了SNI模型建立成功，在本實驗劑量下，使用黑骨藤乙醇提取物治療SNI模型大鼠，可使大鼠的SFI明顯增加，且對SFI的提高呈劑量及時間依賴性，說明本實驗劑量的黑骨藤乙醇提取物治療，可以改善SNI模型大鼠的坐骨神經功能，對SNI模型大鼠神經的功能修復有明顯的治療作用。

周圍神經纖維斷裂后，會出現一系列復雜的病理變化，如斷端遠側的軸突，很快發生華勒氏變性而崩解，近側端發生逆行性退變[11]，是神經功能受損的病理基礎。在本實驗中，坐骨神經HE染色證實，在本實驗時程內黑骨藤乙醇提取物的治療，能夠明顯減輕神經纖維的腫脹、減少神經組織炎癥細胞的浸潤等，幫助神經組織恢復正常的組織形態，且D組較C組效果明顯，術后28 d較術后7、14 d效果明顯，說明本實驗劑量和時程內，黑骨藤乙醇提取物的治療可以改善受損坐骨神經的形態學損傷，減輕炎性反應程度，是本實驗中SNI模型大鼠神經功能改善的病理學基礎。

WNT蛋白家族在神經系統發育過程中，對神經軸突再生等起重要調節作用的，在神經病理性疼痛的發病機制中扮演重要角色。激活WNT信號通路能夠刺激促炎因子TNF-α和IL-1的產生，加重神經病理性疼痛的進展[12]。PNJ后，傷害性刺激從外周傳入中樞，膠質細胞上相關分子模式感知這些信息后，會引起膠質細胞激活，并使炎癥細胞浸潤釋放促炎性細胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，導致坐骨神經發生炎性反應[13-14]，神經炎性反應使傳遞痛覺的神經元興奮，促進中樞敏化形成，在行為上則表現為痛覺等現象[15]。神經炎性反應在神經病理性疼痛的形成中起著關鍵作用，減輕神經炎性可以減輕疼痛保護改善神經損傷[12]。本實驗結果顯示，與B組比較，C組在術后28 d TNF-α水平明顯降低，D組術后7 d IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。證實了黑骨藤乙醇提取物的治療可減輕SNI模型大鼠神經炎癥從而減輕神經疼痛，改善損傷的神經功能。

傳統醫藥中，黑骨藤主要用于跌打損傷、風濕等痛證。本研究以近年來免疫炎癥理論在PNJ中的應用為前提，結合課題組前期研究工作，建立坐骨神經鉗夾傷模型，證實黑骨藤對SNI有一定保護作用，并且其藥效與劑量、時間有關，其作用機制可能與抑制免疫炎癥因子分泌有關。