浙鮮9號的航天選育與特征特性分析

傅旭軍 楊清華 袁鳳杰 郁曉敏 金杭霞 朱申龍 朱丹華

(浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021)

航天誘變育種是指利用太空中宇宙空間特殊的環境誘變因子對作物的種子、組織、器官等材料進行空間誘變，使植物基因發生變異后再返回地面進行常規選育的育種新途徑[1-3]。該育種方法能夠誘發自然界稀有的或用一般常規方法較難獲得的新類型、新性狀、新基因，具有擴大變異頻率及變異性狀穩定、速度快等優點，因此航天誘變受到了廣大育種專家的重視[4-5]。目前，該育種技術已在糧油作物[6-11]、蔬菜作物[12-15]、園藝作物[16-17]等育種領域得到廣泛的應用。大豆航天誘變育種的研究與應用起步較晚，經過多年對其誘變效應、后代分離規律、選擇方法等技術環節的探索，目前也已初見成效[18-23]。2003年至今，科學家進行了多次大豆航天搭載研究，育成了一批具有高產、優質的突變體和新品系，并通過國家或省級審定[24-26]。

鮮食大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.]俗稱毛豆，是指在豆莢鼓粒飽滿而莢色仍呈翠綠時采青食用的專用大豆品種，味道鮮美，營養豐富，在我國南方地區很受消費者的青睞。臺灣75是近幾年我南方地區鮮食大豆的主栽品種，該品種產量高、品質優，但對大豆花葉病毒病抗性較差，且經過多年種植以后，種性退化日趨嚴重。為培育優良鮮食大豆新品種，滿足日益增長的國內外市場需求，本研究以臺灣75為材料，利用返回式衛星“實踐八號”搭載空間誘變處理，經系譜法選育了高產優質抗病的鮮食大豆新品種浙鮮9號。為進一步明確大豆航天誘變后代在產量、品質和抗性等方面的變異和選擇效果，本試驗對浙鮮9號與親本臺灣75的產量和主要農藝性狀進行了比較研究，旨在闡明航天誘變技術對鮮食大豆的育種效應。

1 材料與方法

1.1 材料

浙鮮9號(原代號航豆3-2)和對照品種臺灣75(浙鮮9號供體親本)，均由浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 特征特性調查和產量對比試驗 根據2012-2013年浙江省鮮食春大豆區域試驗，共8個試點考察記載了浙鮮9號和親本臺灣75的植物學特征特性和產量數據，試驗采用完全隨機區組設計，重復3次，小區面積13 m2，每區3行，株距0.25 m，每公傾密度1.8萬株，常規管理，實收計產。

1.2.2 SSR標記檢測方法 取苗期新鮮葉片用CTAB法[27]提取DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，選取60對來源于20條不同連鎖群的SSR引物，引物序列來自大豆數據庫(http：//soybase.agron.iastate.edu/ssr.html)，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應體系為10 μL：DNA模板 1 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol·L-1)，GoTaq Green Mix(Promega公司，美國)6 μL、超純水2 μL。反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃終延伸10 min。取3 μL擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h，銀染檢測。

1.2.3 SNP標記檢測方法 基因組DNA提取同SSR檢測方法，選取來源于20條染色體的100個SNP標記，引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。利用LightCucler?480Ⅱ定量PCR儀(Roche, IN,USA)進行PCR擴增和HRM過程。反應體系為20 μL：2 μL DNA(25 ng·μL-1)，4 μL 5x EVA Green Realtime PCR Mix(GeneSolution)，0.4 μL 上下游引物(10 μmol·L-1)，13.2 μL去離子水。反應程序：95℃預變性15 min，95℃變性15 s、60℃退火20 s、72℃延伸15 s，4個循環。HRM過程：95℃ 1 min、40℃ 1 min、60℃ 1 s，60～95℃(升溫速率0.02℃·s-1)，HRM結束后，產物冷卻至40℃保持10 s。

1.2.4 品質分析與抗性鑒定 取新鮮豆莢樣品500 g，委托農業部農產品測試中心(杭州)進行品質分析，采用中華人民共和國國家標準GB/T 5009.8-2008[28]和GB/T 5009.9-2008[29]分別測定可溶性糖和淀粉含量；大豆花葉病毒抗性由南京農業大學國家大豆改良中心采用人工汁液摩擦接種法接種SC-15和SC-18株系進行鑒定。

1.3 數據分析

表型數據分析采用中國水稻研究所科技信息中心Excel統計分析軟件(Excel Stat1.6)進行。高分辨率熔解曲線分析采用LightCucler?480軟件(v1.5.0)的Gene Scanning模塊進行。

2 結果與分析

2.1 浙鮮9號的選育

2006年9月9日，取500 g臺灣75干種子(含水量控制在13%左右)搭載于“實踐八號”航天育種衛星，在酒泉衛星發射中心發射升空，在軌飛行15 d，衛星軌道傾角63°，近地點180 km，遠地點460 km，9月24日在四川遂寧成功回收。2007年春季種植SP1，開花期、株高等性狀稍有不整齊，但無明顯分離現象，未出現不育株，成熟后摘莢混收。而親本臺灣75生長整齊，開花一致，無分離現象。2008年種植SP2群體，諸多性狀上均有較大的分離，出現高稈、矮稈、早熟和晚熟等突變體。當年按照熟期、株高等性狀選擇優良單株100株，秋季加代成株系。2009年按株系編號種植，其中航003株系表現成熟期較臺灣75早，結莢性好，當年秋季擴繁。2010年春季發現個體間倒2節結莢性差異明顯，當年選擇倒2節結莢好的20個單株，秋季再擴繁成株系，其中航003-2的株系表現較好，當年冬季在海南加代，2011年在杭州、蕭山和海寧進行多點比較試驗，病毒病抗性和產量明顯優于臺灣75。2012-2013年參加浙江省鮮食大豆區域試驗，其鮮莢產量詳見表1。

2.2 浙鮮9號與親本臺灣75的主要植物學性狀

浙鮮9號生育期(播種至采收)約83 d，有限結莢習性，株型收斂，株高中等偏矮，節間較短，葉片卵圓形，葉色偏淡，白花，灰毛，青莢淡綠色，豆莢鐮刀形，莢寬粒大，包衣多，籽粒圓形，種皮綠色，子葉黃色，臍黃色，中抗大豆花葉病毒病。臺灣75生育期(播種至采收)約85 d，有限結莢習性，株型收斂，株高中等，節間較長，葉片卵圓形，葉色較深，白花，灰毛，青莢深綠色，豆莢鐮刀形，莢寬粒大，包衣多，籽粒圓形，種皮綠色，子葉黃色，臍黃色，高感大豆花葉病毒病。

2.3 浙鮮9號與親本臺灣75主要農藝性狀和產量的比較分析

根據浙江省2012-2013年鮮食春大豆區域試驗浙鮮9號和親本臺灣75的主要農藝性狀和產量的比較可知，浙鮮9號的生育期(播種至采收)為83.3 d，較親本臺灣75短2 d，未達到顯著水平；株高33.8 cm，比親本矮7.0 cm；與親本臺灣75相比，浙鮮9號的鮮百莢重高了6.1 g，鮮百粒重低了2.2 g，主莖節數少0.2節，有效分枝數少0.2個，單株有效莢數多0.3個，均未達顯著水平。浙鮮9號青莢色為淡綠，親本臺灣75為深綠。浙鮮9號2年區域試驗鮮莢平均產量為9 372.1 kg·hm-2，較親本臺灣75顯著增產9.4%(表2)。綜上可知，航天誘變對產量、生育期、株高、鮮百莢重、莢色等農藝性狀影響較大，而對主莖節數、有效分枝數、單株有效莢數等農藝性狀影響較小，浙鮮9號較親本增產的主要原因是鮮莢產量構成因素鮮百莢重的增加。

表1 浙鮮9號區域試驗鮮莢產量表現Table 1 Flesh pods yield of Zhexian No.9 in region test

表2 浙鮮9號與臺灣75產量與農藝性狀的差異Table 2 Yield and agronomic differences of Zhexian No.9 and Taiwan 75

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。

Note：*and**mean significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.4 浙鮮9號與親本臺灣75的品質及抗性比較分析

由表3可知，浙鮮9號鮮豆可溶性總糖含量為2.88%，比親本高0.28%，未達顯著水平；淀粉含量4.69%，比親本高0.49%，未達顯著水平。浙鮮9號和親本臺灣75接種浙江省大豆花葉病毒病強致株系SC-15 和流行株系SC-18，2012年結果顯示浙鮮9號中抗SC-15、SC-18株系，親本臺灣75高感SC-15、感SC-18株系；2013年結果顯示浙鮮9號中抗SC-15、中感SC-18株系，親本臺灣75感SC-15、感SC-18株系。表明航天誘變對臺灣75可溶性總糖和淀粉的影響不大，而對大豆花葉病毒病的抗性改良影響較大。

2.5 浙鮮9號與親本臺灣75 SSR分子標記的比較分析

利用60對分別位于20條連鎖群SSR核心引物對浙鮮9號和臺灣75進行分子標記分析，部分SSR結果見圖1，有Satt184、Satt197、Satt226、Satt236、Satt307、Satt373、Satt414、Satt462、Satt559、Sat-213等10對SSR引物在兩者的擴增結果上有明顯差異，品種間的多態率為16.7%。前人把大豆花葉病毒病抗性基因RSC15 精細定位到第6號染色體上的一個95 kb的區域，兩側是SSR標記ssr_06_17和barcsoyssr_06_0835[30]，其中位于這段區間的SSR標記Sat-213，在兩者之間也有明顯差異，這從分子水平也證明了浙鮮9號對大豆花葉病毒病抗性的改良。

表3 浙鮮9號與臺灣75鮮豆品質和大豆花葉病毒病抗性的差異Table 3 Quality of fresh bean and resistance to soybean mosaic virus differences of Zhexian No.9 and Taiwan75

注：奇數泳道為浙鮮9號的擴增結果，偶數泳道為臺灣75的擴增結果。Note: The singular lane is the amplification result of Zhexian No.9, the double lane is the amplification result of Taiwan 75.圖1 浙鮮9號和臺灣75部分SSR標記遺傳差異Fig.1 SSR genetic differences of Zhexian No.9 and Taiwan75

2.6 浙鮮9號與親本臺灣75 SNP分子標記的比較分析

利用100個分別位于20條連鎖群SNP分子標記對浙鮮9號和臺灣75進行比較分析，結果表明有5個SNP標記在兩者之間存在差異，分別位于第7、第8、第17條染色體上(表4)。第7條染色體上僅有ss715598280、ss715596326、ss715597296 等3個SNP標記存在差異，第8條染色體上僅有ss715602256標記存在差異，第17條染色體上僅有ss715626667標記存在差異。

3 討論

3.1 航天誘變對大豆的生育期、產量和花葉病毒病抗性的改良具有一定的正面效應

航天誘變新品種浙鮮9號在株型、主莖節數、分枝數、有效莢數、每莢粒數、可溶性總糖含量、淀粉含量等性狀上與親本臺灣75有相似之處，但在株高、節間長度、葉片顏色、青莢顏色、生育期、鮮百莢重等性狀和對大豆花葉病毒病的抗性均與親本具有較大差異。與親本臺灣75相比，浙鮮9號播種至采收生育期短2 d、株高較矮、節間較短、葉色和青莢色較淡，百莢鮮重較重，鮮莢產量、對大豆花葉病毒病的抗性顯著提高。浙鮮9號雖然在株高、青莢色等農藝性狀存在著一定的負面誘變效應，但生育期、產量和抗性等方面存在一定的正面誘變效應。首先，浙鮮9號生育期(播種至采收)比親本臺灣75早熟2 d，這對鮮食大豆來說至關重要，早熟能提前上市獲得較好的效益；其次，由于主要產量因子鮮百莢重的提高，使得浙鮮9號鮮莢產量水平較親本有明顯提高。此外，浙鮮9號對大豆花葉病毒病SC-15和SC-18株系的抗性分別提高到了中抗和中感，而親本臺灣75則是高感。這些優良性狀使得浙鮮9號品種自審定以來推廣面積逐年擴大，已基本替代臺灣75成為新的主栽品種。高產、優質、抗病的大豆新品種浙鮮9號成功選育，進一步證明了航天誘變育種的有效性和可靠性[31-32]。

表4 浙鮮9號與臺灣75的多態性SNP標記及引物信息Table 4 Polymorphic SNP markers and primer information of Zhexian No.9 and Taiwan75

3.2 航天誘變產生的多位點基因突變從DNA分子水平得到了初步驗證

對浙鮮9號與親本臺灣75 DNA的SSR分子標記結果表明，有10對SSR引物多態性擴增結果差異明顯，多態率為16.7%；對SNP分子標記比較分析，在第7、第8、第17號染色體上有5個SNP標記存在差異，表明浙鮮9號與親本相比在多個基因位點上產生了突變。基因位點的突變是作物特征特性變異的基礎，這從DNA分子水平初步驗證了航天育種的誘變效果。大豆花葉病毒病抗性基因RSC15的分子標記Sat-213，在浙鮮9號與親本臺灣75之間也表現出明顯差異，進一步從分子水平證明了浙鮮9號對大豆花葉病毒病的抗性改良。有關航天誘變對作物抗性的變異及選擇效果，已有相關報道[33-34]，但關于航天誘變對大豆花葉病毒的抗性變異卻鮮見報道。本研究在浙鮮9號與親本臺灣75之間從田間抗性鑒定結果和抗性基因分子標記分別進行了差異比較分析，均表明航天誘變對大豆花葉病毒病的抗性改良有明顯的效果。

4 結論

本研究通過航天誘變的育種方法選育出浙鮮9號，在生育期、抗性和產量方面較親本臺灣75有了明顯的改良，其遺傳變異在DNA分子水平上得到了初步驗證，表明利用航天誘變育種技術進行品種改良是有效和可靠的。利用大豆花葉病毒病抗性基因RSC15的分子標記Sat-213，從分子水平證實了航天誘變對大豆花葉病毒病抗性的改良效果，但針對生育期和產量性狀在分子水平上的作用機理還需進一步研究。