光皮樺BlCCoAOMT基因的克隆、表達及單核苷酸變異分析

俞子承 倪 飛 江 成 黃華宏 林二培 童再康

(浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300)

木質素是由多種不同的木質素單體氧化偶聯形成的異質性細胞聚合物，為植物次生壁主要成分，在木本植物中約占13%～35%，在植物體機械支撐、水分輸送、抵御外界侵襲等方面起著重要的作用[1]。被子植物木質素單體的生物合成過程十分復雜，參與木質素生物合成途徑的相關酶類也較多[2-3]。其中咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase，CCoAOMT)是甲基化反應的重要酶類，能夠催化咖啡酰輔酶A生成阿魏酰輔酶A，且在整個木質化過程發揮作用[4-6]。木質素以其堅固、穩定和難以分解的特質，廣泛應用于建筑、軍工等行業，目前已有關于木質素合成的分子機制、調控木質素的生物合成、改變木質素的組成結構等相關研究報道，如Do等[7]通過T-DNA插入突變的方法抑制了擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCCoAOMT1基因的表達，獲得缺陷植株的木質素含量較對照降低約26%。Li等[8]發現下調玉米(Zeamays)ZmCCoAOMT1基因表達的缺陷植株與野生型相比，木質素含量下降了22.4%，纖維素含量增加了23.3%。Zhong等[9]研究發現CCoAOMT是雜交楊(Populustremula×P.alba)木質素合成中的關鍵酶之一，通過反義抑制其編碼基因的表達，會導致總木質素含量顯著下降。此外，研究表明調控CCoAOMT基因的表達能夠影響木質素單體的比例，改變木質素結構和性質[10-11]。因此，CCoAOMT基因的研究價值和應用前景極高。

光皮樺(Betulaluminifera)又名亮葉樺，是我國特有的速生用材樹種，主要分布于我國南方地區，其材質優良，在航空、建筑、家具、造紙等行業應用廣泛，已被多省列為優選推廣的珍貴樹種，且被國家列入戰略儲備樹種[12]。近年來，浙江農林大學黃華宏課題組相繼對4CL、OFP、KNOX等多個關鍵基因家族的序列、表達和功能進行了研究，并初步了解了它們在木質素生物合成中的作用[13-15]，但尚未對CCoAOMT編碼基因進行系統研究。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因組水平上，單個核苷酸變異所造成的序列多態性。SNP具有數量多、分布廣等特點。趙宏亮等[16]在水稻(Oryzasativa)的12條染色體上檢測到的 6 704個SNP變異位點，幾乎分布于整個基因組中。來自功能基因中的一些SNP位點與目標性狀變異有重要的關聯。如鞏琛銳等[17]研究表明毛白楊(Populustomentosa)S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA在不同基因型中存在豐富的SNP變異，其中3個SNP位點與木材品質性狀(纖維長度和微纖絲角)顯著關聯，可作為優良木材品質性狀早期選擇的重要標記。因此，開展目標性狀候選基因內SNPs的發掘和關聯分析，可為深入解析基因功能提供依據[18]。

本研究以不同來源的光皮樺為材料，分離BlCCoAOMT基因序列，進行序列特征、組織表達特異性分析，開展該基因的SNP變異分析，以期為深入解析該基因功能和分子標記輔助育種奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以2年生光皮樺LA0406無性系為試驗材料，盆栽于浙江農林大學良種基地溫室內，氣溫控制在20～28℃之間。共采集根、葉芽、幼葉、雌花序、雄花序，以及不同木質化莖段等10種器官或組織，采樣時間為4月初至5月底。莖取自當年生枝條，從頂端向下依次截取第1、第2、第3、第5和第7節間，分別標為Internode 1、Internode 2、Internode 3、Internode 5和Internode 7，經解剖觀測第1、第2節莖段的木質化區域很少，第3、第5和第7節莖的木質部比例較高[14]；葉(leaf)取自2個不同發育時期，分別為葉芽(leaf bud)、幼葉(young leaves)，標為leaf 1、leaf 2；雄花(male inflorescence)、雌花(female inflorescence)均取自樹冠中上部；根(root)取自該無性系的水培植株。應拉木誘導處理參照何輝等[19]的方法，將生長相對一致2年生植株拉彎處理，分別在處理6 h、48 h、7 d時，刮取應拉木(tension wood)和對應木(opposite wood)發育木質部，同時取直立植株相同高度的木質部作為對照(CK)。每處理設3次生物學重復。所有樣品經液氮速凍后，-80℃貯存備用。

分別從福建尤溪、廣西龍勝花坪自然保護區、江西龍南九連山和浙江臨安太湖源4個光皮樺群體共采集73個植株的葉片，具體采集方法參照張俊紅等[20]的報道。提取的葉片DNA用于BlCCoAOMT基因內SNP分析。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改良CTAB法[15]提取光皮樺葉片基因組總DNA。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 參照PureLinkTMPlant RNA Reagent試劑(美國Thermo Fisher公司)說明書提取不同組織的RNA。cDNA第一鏈的合成按照TaKaRa(日本)公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進行。

1.2.3BlCCoAOMT基因的分離 基于光皮樺轉錄組測序庫中CCoAOMT基因片段設計5′和3′RACE引物(GSP1和GSP2)[12]，配合通用引物UPM，采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(ClonTech公司，美國)進行RACE的擴增。將獲得的目的片段，通過美國TransGen公司的pEASY-T1 Simple Cloning Kit進行載體連接，隨后轉化DH5α大腸桿菌菌株[TaKaRa(日本)公司]。采用PCR方法鑒定陽性重組子后送南京金斯瑞公司測序，拼接得到BlCCoAOMT基因序列全長。進一步在5′和3′非翻譯區(UTR)設計引物進行PCR和克隆測序以驗證其正確性。相關引物序列見表1。

表1 本試驗所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.2.4 生物信息學分析 利用DNASTAR軟件中的EditSeq確定開放閱讀框(open reading frame，ORF)和預測氨基酸序列、分子量(kDa)及等電點(pI)。利用Clustal X2軟件對CCoAOMT蛋白序列進行多序列比對。用MEGA7.0軟件構建不同植物的CCoAOMT蛋白的進化樹，分析進化關系[21]。采用基因結構顯示系統(GSDS，http://gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制基因結構圖。

1.2.5 基因表達分析 根據PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒[TaKaRa(日本)公司]操作按照說明書將光皮樺RNA反轉錄成cDNA。采用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)熒光定量PCR試劑盒[TaKaRa(日本)公司]分析BlCCoAOMT基因在各器官或組織中，以及應拉木形成早期階段的表達情況。以BlActin作為定量PCR內參基因，相關引物序列詳見表1。

1.2.6 SNP多樣性分析 以來自4個群體的73個不同基因型植株DNA為模板，采用全長驗證引物(full-length RT-PCR)、高保真Taq酶(TransGen公司，美國)進行PCR；擴增產物經電泳回收后，連接pEASY-Blunt Simple Vector載體(TransGen公司，美國)并轉化大腸桿菌DH5α；通過PCR篩選出陽性克隆，送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。利用DnaSP 6.10軟件[22]對BlCCoAOMT基因序列SNP位點分布、轉換和顛換的數量，以及同義突變、錯義突變和無義突變情況等進行分析。

2 結果與分析

2.1 BlCCoAOMT基因的克隆及序列分析

獲得的BlCCoAOMT(GenBank注冊號為FJ410449)cDNA全長為1 114 bp，含有一個744 bp的完整ORF。編碼蛋白由247個氨基酸組成，相應分子量為27.8 kDa、理論pI為5.42。多序列比對顯示，光皮樺BlCCoAOMT與白樺(Betulaplatyphylla)BpCCoAOMT相似度最高，二者核酸序列的一致性為95.9%，編碼蛋白氨基酸序列一致性為98.4%。進一步擴增BlCCoAOMT基因組序列，發現該基因編碼區被4個內含子分割(圖1)。將其基因組序列與對應的毛果楊(Populustrichocarpa)PtrCCoAOMT1基因組序列進行同源性比較(表2)，結果表明BlCCoAOMT與PtrCCoAOMT1編碼區所覆蓋的基因組總長度分別為 1 391 bp和1 227 bp，二者具有相同的基因結構，即含有5個外顯子和4個內含子。這2個基因對應外顯子的堿基數完全相同，但內含子區域差異明顯。進一步對這2個物種CCoAOMT基因內部的外顯子和內含子的同源性進行比較，發現BlCCoAOMT與PtrCCoAOMT1的外顯子相似性均在80%以上，而內含子的相似性介于40.2%～54.5%之間。

注：黑色方框、黑色線條分別代表外顯子和內含子。Note: The black boxes and black lines represent exons and introns, respectively.圖1 光皮樺CCoAOMT基因結構示意圖Fig.1 The gene structure of the CCoAOMT in B.luminifera

表2 光皮樺CCoAOMT和毛果楊CCoAOMT1基因組DNA結構比較Table 2 Comparison of genomic DNA structures of CCoAOMT gene in B. luminifera and P. trichocarpa

注：“-”表示無數據。

Note: ‘-’ means no data.

2.2 BlCCoAOMT氨基酸序列比較及進化分析

由圖2可知，BlCCoAOMT氨基酸序列包含CCoAOMT序列中所有的保守元件，其中A、B、C為植物甲基轉移酶中普遍存在的保守序列元件，通常認為這3個元件并非底物的特異結合位點，而與甲基供體SAM的結合有關。D、E、F、G、H為CCoAOMT所特有的標簽序列[23]。

由圖3可知，CCoAOMT可被分為4個亞類，其中BlCCoAOMT與白樺BpCCoAOMT、毛果楊PtrCCoAOMT1和PtrCCoAOMT2、毛白楊PtCCoAOMT、擬南芥AtCCoAOMT1，以及煙草(Nicotianatabacum)NtCCoAOMT1序列相似，聚在第一亞類。毛果楊PtrCCoAOMT3、PtrCCoAOMT4和PtrCCoAOMT5，以及擬南芥AtCCoAOMT2、AtCCoAOMT3、AtCCoAOMT4、AtCCoAOMT5、AtCCoAOMT6和AtCCoAOMT7分屬其他三個亞類。

注：At：擬南芥；Bl：光皮樺；Bp：白樺；Bpa：構樹；Ej：枇杷；Gh：陸地棉；Ptr：毛果楊；下劃線(A-H)：保守序列元件。Note: At: Arabidopsis thaliana. Bl: Betula luminifera. Bp: Betula platyphylla. Bpa: Broussonetia papyrifera. Ej: Eriobotrya japonica. Gh: Gossypium hirsutum. Ptr: Populus trichocarpa. Underline(A-H): Conserved sequence elements.圖2 光皮樺BlCCoAOMT與同源蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of BlCCoAOMT with homologous proteins

2.3 BlCCoAOMT基因表達分析

由圖4可知，BlCCoAOMT在第3節、第5節、第7節莖段表達量均顯著高于其他組織，且第7節莖段中表達量最高(5.930)，在第1節、第2節莖段中表達量均較低，分別為0.922和1.437，在根、雌花中的表達量均與幼葉差異顯著，且在葉芽中的表達量最低(0.518)，表明BlCCoAOMT基因可能與其木質化有關。

應拉木是指在外力作用下造成的彎曲樹干或樹枝試圖恢復到原來位置，所形成的解剖、物理力學性質明顯不同的木材[24-25]。在光皮樺中，拉彎處理會使應拉木的細胞壁明顯增厚，平均纖維長度增加、纖維素含量增加，以及木質素含量下降[13]。由圖5可知，與直立木(CK)相比，拉彎處理早期階段應拉木(TW)中BlCCoAOMT基因的表達量呈下降趨勢，且相應數值皆顯著低于CK；在對應木(OW)中的表達量則是先下降后上升，拉彎7 d時恢復到CK水平。

2.4 BlCCoAOMT基因SNP多樣性分析

由表3可知，在1 651 bp長度的BlCCoAOMT基因片段中出現了3次插入和4次缺失的突變，且均發生在非編碼區，同時檢測到119個SNPs，其中單變異位點(singleton variable sites)10個，簡約信息位點(parsimony informative sites)109個(含12個三態SNP位點)，平均每14 bp就有1個SNP位點。由表4可知，在5′非翻譯區、外顯子、內含子、3′非翻譯區分別檢測到4、26、80、9個SNPs，SNP位點數與堿基對數比例分別為5.6%、3.4%、12.5%、7.7%，其中8個保守元件對應區域存在18個SNPs。進一步對檢測到的107個二態SNPs進行變異類型統計，其中62個屬于轉換，45個屬于顛換(表5)。

進一步對編碼區內檢測到的26個SNPs進行了突變類型分析，以確認BlCCoAOMT基因編碼區的SNPs是否引起編碼氨基酸的改變。由表6可知，在26個SNPs位點上，同義突變的有21個，其中8個保守元件對應區域有16個；錯義突變的5個，其中2個在保守元件D的對應序列上；不存在無義突變。全部的5個錯義突變位點共引起5種氨基酸改變。突變位于密碼子第1個核苷酸位點的有3個，即在編碼區第135位密碼子改變，由GGC突變為AGC，導致其編碼的氨基酸由甘氨酸(Gly)變為絲氨酸(Ser)；第302位密碼子改變，由TCC突變為CCC，氨基酸由脯氨酸(Pro)變為絲氨酸(Ser)；第320位密碼子改變，由AAG突變為GAG，氨基酸由賴氨酸(Lys)變為谷氨酸(Glu)。而位于第2個和第3個核苷酸的位點各有1個。

注：At：擬南芥(AT4G34050；At1g24735；At3g61990；At3g62000；At1g67990；At1g67980；At4g26220)；Bl：光皮樺(FJ410449)；Bp：白樺(KT223488)；Bpa：構樹(AY579076)；Ej：枇杷(JX885583)；Gh：陸地棉(FJ376606)；Nt：煙草(U38612)；Pto：毛白楊(EU760389)；Ptr：毛果楊 (649581；829835；837287；805093；820698；755509)；Zm：玉米(NM_001320647；AJ242981)。Note: At: Arabidopsis thaliana(AT4G34050; At1g24735; At3g61990; At3g62000; At1g67990; At1g67980; At4g26220). Bl: Betula luminifera(FJ410449). Bp: Betula platyphylla(KT223488). Bpa: Broussonetia papyrifera(AY579076). Ej: Eriobotrya japonica(JX885583). Gh: Gossypium hirsutum(FJ376606). Nt: Nicotiana tabacum(U38612). Pto: Populus tomentosa(EU760389). Ptr: Populus trichocarpa(649581; 829835; 837287; 805093; 820698; 755509). Zm: Zea mays(NM_001320647; AJ242981).圖3 光皮樺CoAOMT蛋白與其他植物CCoAOMT的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of BlCCoAOMT and other related species CCoAOMT protein

表3 光皮樺BlCCoAOMT基因組序列中的插入和缺失情況Table 3 Summary of insertion and deletion in BlCCoAOMT gene sequence

表4 在BlCCoAOMT基因不同區域SNP數量及頻率Table 4 Number and frequency of SNPs in different regions of BlCCoAOMT

表5 BlCCoAOMT基因內部SNP的替代類型Table 5 The substitution types of SNPs for BlCCoAOMT

注：Root：根；Internode 1：第1節間；Internode 2：第2節間；Internode 3：第3節間；Internode 5：第5節間；Internode 7：第7節間；Leaf 1：葉芽；Leaf 2：幼葉；FC：雌花；MC：雄花。以Root為參照，不同小寫字母 表示在0.05水平差異顯著。Note: Root: Root. Internode 1: The first internode. Internode 2: The second internode. Internode 3: The third internode. Internode 5: The fifth internode. Internode 7: The seventh internode. Leaf 1: Leaf bud. Leaf 2: Young leaves. FC: Female inflorescence. MC: Male inflorescence. Root was used as a reference, the different small letters indicate significant difference at 0.05 level.圖4 不同器官和組織中BlCCoAOMT基因的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of BlCCoAOMT in different organs and tissues

注：OW：對應木；TW：應拉木；CK：對照組。*表示在0.05水平差異顯著。Note: OW: Opposite wood. TW: Tension wood. CK: The controls. * indicates significant difference at 0.05 level.圖5 應拉木形成中BlCCoAOMT基因的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of BlCCoAOMT during the formation of tension wood

2.5 不同群體內BlCCoAOMT的遺傳分化特征

核苷酸多樣性是衡量一個群體之中遺傳多樣性的重要參數。多樣性數值越小，代表著群體的多樣性程度越低[26]。由表7可知，利用119個SNP位點計算得到多樣性指數πtot、πsil、πs、πn，顯示這些參數在4個群體間都存在一定差異，但均未達到顯著水平，表明在不同群體間BlCCoAOMT基因的分化程度無顯著差異。所有4個群體的非同義突變多樣性指數πn均小于同義突變πs，說明在光皮樺的進化過程中，BlCCoAOMT基因主要受到純化的選擇壓力。利用DnaSP 5.0軟件對4個群體進行了Tajima′s D和Fu and Li′s D的中性檢驗，發現福建尤溪、廣西龍勝和江西龍南3個群體Tajima′s D均為負值，表明這些群體中存在較多低頻率的等位基因，僅浙江臨安群體Tajima′s D為正值，暗示中等頻率的等位基因占主導。福建尤溪和廣西龍勝2個群體Fu and Li′s D均為負值，表明進化過程中存在較多變異，多樣性豐富；而江西龍南和浙江臨安為正值，表明進化過程中，正向選擇占主導地位[27-28]。

表7 BlCCoAOMT基因在群體內的核苷酸變異Table 7 Summary of nucleotide variation in 4 populations for BlCCoAOMT

注：πtot：整個基因區域單核苷酸多樣性；πsil：非翻譯區和內含子區域的單核苷酸多樣性；πs：編碼區同義突變單核苷酸多樣性；πn：編碼區內非同義突變多樣性。Tajima′s D和Fu and Li′s D為兩種不同檢驗中性進化的方法得到的D值。

Note: πtot: Average nucleotide diversity in full gene. πsil: Average nucleotide diversity in untranslated regions and introns. πs: Average nucleotide diversity of synonymous mutation. πn:Average nucleotide diversity of non-synonymous mutation. Tajima′s D and Fu and Li′s D are D values calculated by the two neutral evolution test.

3 討論

CCoAOMT是調控植物苯丙烷類物質合成的重要基因，多以基因家族的形式存在，如擬南芥和毛果楊基因組中分別含7個和6個CCoAOMT成員。本研究從光皮樺中克隆到1個BlCCoAOMT的cDNA序列，編碼蛋白包含植物CCoAOMT應有的8個保守序列，且相應基因組序列中含有5個外顯子。植物CCoAOMT可分為4個亞類，不同亞類的基因結構不同，屬Ⅰ-Ⅲ亞類的CCoAOMT含5個外顯子，Ⅳ亞類的則含9個外顯子，與Tsai等[29]研究結果一致。BlCCoAOMT的基因組序列中含5個外顯子，且在系統進化樹中與擬南芥AtCCoAOMT1、煙草NtCCoAOMT1、毛白楊PtCCoAOMT聚為一類。AtCCoAOMT1主要在花序莖和根的維管組織中高度表達，該基因缺失突變體的主莖纖細并伴有木質部塌陷的現象，木質素含量明顯低于對照[7]。NtCCoAOMT1在木質素的生物合成中發揮重要作用，主要在根和木質化程度較高的莖段中表達[30]。趙華燕[31]發現PtoCCoAOMT主要在莖及發育的木質部中表達，通過反義RNA技術下調該基因表達，導致轉化植株木質素含量降低。本研究發現BlCCoAOMT在木質化莖段中優勢表達，且具有隨木質化程度提高而增強的趨勢，在拉彎處理早期階段，該基因在應拉區發育木質部中的表達呈顯著下調，與應拉木木質素含量的下降相符。因此，推測BlCCoAOMT基因參與光皮樺木質素的生物合成。

以來自4個群體的73個不同基因型植株為材料，共檢測到BlCCoAOMT基因組序列中存在119個SNPs位點，SNP位點數與堿基對數的比值為0.071，高于光皮樺BlSPL1基因[32](比值為0.038)，毛白楊PtCesA4基因[33](比值為0.029)和竹類植物Dwarf14基因[34](比值為0.045)。可見，該基因SNP變異豐富，其與個體木質素含量間的關系值得深入研究。在這些SNP變異位點中，位于編碼區和兩側非翻譯區的SNPs變異頻率遠低于內含子區域，表明這些區域受到了較強的選擇壓力，發生在編碼區內的非同義突變與同義突變的比率為0.24<1，顯示在光皮樺演化過程中受到了純化選擇壓力[35]。SNP在CG序列上出現最為頻繁，且多為C→T，與毛白楊和小葉楊部分基因的研究結果類似[36]，其原因可能是CG中C(胞嘧啶)易發生甲基化、自發地脫氨轉換成T(胸腺嘧啶)相關。雖然不同群體間BlCCoAOMT基因的分化程度無顯著差異，但在福建尤溪和廣西龍勝2個群體中，BlCCoAOMT基因在進化中存在較多的低頻率SNPs，這可能是由于在這2個群體SNPs中受到負選擇作用而保持較低的比例[35]。

基于候選基因的關聯分析是目前開展林木分子輔助育種研究的重要策略之一。近年來關于黑楊(Populusnigra)、毛白楊、輻射松(Pinusradiata)等樹種的相關研究已挖掘出一批與性狀顯著關聯的SNP標記，并有望在育種實踐中發揮作用[37-39]。本研究推測BlCCoAOMT基因參與光樺木質素生物合成，并發現該基因存在有豐富的SNP變異，為下一步通過關聯分析解析該基因SNPs位點與個體木質素含量間的關系奠定了基礎。

4 結論

本研究結果表明，從光皮樺樹中克隆的1個BlCCoAOMT基因，編碼蛋白具CCoAOMT酶所有的8個典型保守基序；BlCCoAOMT主要在木質化莖段中表達，且隨木質化程度提高而增強；拉彎處理能抑制BlCCoAOMT在應拉區發育木質部中的表達，推測該基因參與光皮樺木質素的生物合成。BlCCoAOMT基因序列中存在4個內含子，在檢測個體中存在豐富SNP變異，外顯子區SNP的變化特點暗示該基因在光皮樺演化進程中主要受到了純化選擇壓力。本研究結果為進一步闡明BlCCoAOMT基因SNP變異與木質素含量間的關系，以及分子輔助木材品質改良提供了理論支撐。