2個抗病相關基因與高油酸油菜病害關系分析

王曉丹 陳 浩 張振乾 官春云

(湖南農業大學南方糧油作物協同創新中心/水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

據統計，全世界目前已知的油菜病害有100多種，我國已發現30多種，包括真菌、病毒、細菌病害等[1]。其中菌核病[Sclerotiniasclerotiorum(L.)deBary]、病毒病(Turnipmosaicvirus)及霜霉病[Peronosporaparasitica(Pers.)Fr.]是我國油菜(BrassicanapusL.)三大主要病害，嚴重危害油菜產量[2-5]。研究表明，高油酸油菜品種具有油酸含量高、營養成分豐富等優點，且具有很好的營養保健功能[6]。高油酸油菜已成為當前油菜育種領域的熱點，受到了國內外研究者的高度重視[7]。但與常規油菜相比，高油酸油菜抗病性較差[8]，且關于高油酸油菜研究多集中于分子機理研究及新品種選育等方面[9-11]，對其抗病相關研究尚不常見。

實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)具可靠性強、靈敏度高等特點，廣泛應用于不同作物的抗性基因表達與抗性相關性研究[12-14]。在油菜中，已有利用RT-qPCR技術在耐旱、脂肪酸合成等相關基因的表達及其與對應的耐旱生理指標、脂肪酸合成的相關性分析等的報道[15-16]，但關于抗病基因與抗病性關系的研究尚鮮見報道。

本研究以高油酸油菜近等基因系材料授粉后20～35 d種子為試驗材料，進行miRNA測序，得到與抗病相關差異miRNA的靶基因，即熱激蛋白90(heat shock proteins 90,HSP90)與自噬相關基因3(autophagy-related gene,ATG3)。HSP90在分子進化上高度保守[17]，廣泛介導脅迫信號的傳遞、參與蛋白和轉錄因子的折疊、蛋白復合體裝配和拆卸、激活底物等，在植物抗逆性中起著重要作用[18-19]。ATG3廣泛參與動植物各種生物及非生物脅迫等[20-22]。本研究對HSP90和ATG3基因在甘藍型高油酸油菜中表達規律及相關材料病害調查進行研究，旨在找出其內在關聯，以期為高油酸油菜抗病材料篩選提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以20個(編號1～20)甘藍型高油酸油菜品系為試驗材料[由國家油料改良中心(湖南分中心)提供]，采用7890B型氣相色譜儀(Agilent，USA)測定各品系脂肪酸成分(表1)。

試驗于2017年10月-2018年5月在湖南農業大學耘園基地進行。每個小區面積10 m2，密度12萬株·hm-2，各設3次生物學重復。

表1 20個油菜品系脂肪酸成分組成Table 1 Fatty acid composition of 20 high oleic acid rapeseed /%

1.2 試驗方法

1.2.1 病害調查 在高油酸油菜授粉后35 d對各個品系所有植株進行病害調查(菌核病和病毒病)，分別統計發病株數量，并進行病情分級。其中，0級：整株無癥狀；1級：33.33%以下植株有病斑，受害角果低于25%；2級：整株33.33%～66.67%發病，受害角果數達25%～50%；3級：全株66.67%以上發病，受害角果數達50%～75%；4級：全株發病，絕收或極少角果。發病率和病情指數的統計分析參考劉勝毅[23]的方法。

1.2.2 RNA提取 分別取幼苗期、五～六葉期、蕾苔期和盛花期倒數第3片伸展葉，盛花期花蕾、盛開的花和即將凋謝的花混合，以及角果期自交授粉后15、25、35 d 的自交種子。每次取5株樣品，混合提取RNA，分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(Thermo,USA) 檢測其質量和濃度，于-80℃保存備用。

1.2.3 RT-qPCR分析HSP90和ATG3引物通過Premier 6.0設計(表2)，Oligo 7.0檢測，由擎科生物技術有限公司(長沙)合成。用上述檢測合格的RNA按照TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)

表2 RT-qPCR引物及內參基因序列Table 2 Sequences of primers and reference gene used for RT-qPCR

試劑盒說明書進行反轉錄。以劉芳等[24]設計的PCR反應程序對引物進行檢測，按照TransScriptTip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，使用CFX96TM Real-Time System(BIORAD，USA)進行RT-qPCR反應(兩步法)。以UBC9為內參基因[25]，采用Pfaffl[26]的方法進行基因表達情況評價。設3次生物學重復。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2010統計數據，并用SPSS 20.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 病害調查結果

對20個高油酸油菜品系的病害調查結果及病情指數和發病率進行了分析，由表3可知，20個供試品系發病率在21%～88%之間，病情指數在0.12～0.57之間。品系1～10的病情指數(<0.3)和發病率(<35%)均較低，表明其抗性較強。對20個品系發病率與病情指數進行相關性分析，結果表明，二者呈極顯著正相關性(P<0.01)，相關系數r=0.972 0(圖1)。

表3 病害調查結果Table 3 Disease survey results

2.2 HSP90基因表達分析及其與抗病指數間的關系

2.2.1HSP90基因表達分析 對20個高油酸油菜品系的HSP90基因在整個生育期中不同材料的表達量進行分析，由圖2可知，除品系4、15、16外，其余品系隨著生育期的推進，HSP基因的表達量逐漸降低，直至花期。花期-花與花期-葉表達量整體無顯著差異(P>0.05)。品系11、12、13、14、15、19、16、17、18在角果期-15 d自交種子中HSP90基因的表達量的表達量較低，在角果期-25 d自交種子中表達量升高后，在角果期-35 d自交種中表達量又降低，但仍高于角果期 -15 d自交種子中的表達量；品系4、5、9、1、8、2、7、3、10、6、20HSP90基因表達量則在整個角果期均呈逐漸增加的趨勢。角果期降雨量增加，植株密度增加，會加劇各種病害發生，尤其是菌核病[27]。HSP90基因作為抗脅迫相關基因，可能參與抵御菌核病侵襲的脅迫反應。

圖1 高油酸油菜品系病情指數與發病率相關性分析Fig.1 Crrelation between disease index and morbidity in high oleic acid rapeseed strains

此外，蕾薹期-葉中品系4、5、9、1、8、7的HSP90基因表達量是內參基因的1.50～3.05倍，但這6個品系病情指數均不大于0.16；而品系20、15、19、17的HSP90基因表達量僅為內參基因的0.26～0.52倍，而病情指數介于0.34～0.57之間。花期-葉中4、1、8、7品系基因表達量是內參基因的1.50～2.42倍，但病情指數均不大于0.16；而品系20、14、15、19、17基因表達量僅有內參基因的0.19～0.42倍，但病情指數介于0.34～0.57之間。綜上表明，HSP90基因表達量≥1.5倍內參時，材料抗病性較強。

注：20個品系按照角果期2種表達模式和病情指數大小進行排序。下同。Note: The rank of 20 vaieties are according to two expression pattern at pod stage and the disease index ranges from small to large. The same as following.圖2 20個高油酸油菜品系中HSP90基因在整個生育期的表達量Fig.2 The expression of HSP90 in 20 high oleic acid rapeseeds at the whole growth stage

2.2.2HSP90基因表達量與抗病指數間的關系 對HSP90基因表達規律與抗病指數間的關系進行研究，由表3可知，在線性分析與非線性分析[28]中，蕾薹期-葉、花期-葉，以及角果期-15 d自交種子、角果期-25 d自交種子、角果期-35 d自交種子中均呈極顯著負相關，且除花期-葉，非線性相關性較線性相關性更高。

對HSP90基因表達規律和抗病指數間有顯著差異的材料進行相關性擬合模型分析發現，總體上非線性函數R2較大，與表3結果一致，表明數據可靠[29](表4)。

表3 HSP90基因表達規律與抗病指數相關性Table 3 Correlation between HSP90 gene expression pattern and disease resistance index

注：*與**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。下同。

Note:*and**indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level,respectively. The same as following.

2.3 ATG3基因表達量與抗病指數間的關系

2.3.1ATG3基因表達分析 對20個高油酸油菜品系的ATG3基因在整個生育期中不同材料表達量進行分析，由圖3可知，與HSP90基因在整個苗期葉的表達規律相反，大多數品系在生長前期呈逐漸升高的趨勢直至花期。在花期-花與花期-葉的表達量之間無顯著差異(P>0.05)。在角果期AGT3基因的表達規律呈2種趨勢，品系4、11、20、13、14、15、19、16、17、18在角果期-15 d自交種子中表達量較低，在角果期-25 d自交種子中表達量升高，然后在角果期-35 d自交種子中表達量又降低；品系5、9、1、8、2、7、3、10、6、12的ATG3基因則在整個角果期呈逐漸升高的趨勢。

結合圖1與圖3，對ATG3基因在生長早期表達情況與病情指數有顯著差異的材料進行研究發現，五～六葉期-葉中，品系4、1、8、2、7基因表達量是內參基因的1.85～4.45倍，但其病情指數均不大于0.16，反之品系12、11、19、18基因表達量僅內參基因的1.11～1.28倍，而病情指數介于0.34～0.57。花期-葉中品系4、5、9、1、8、2、7病情指數介于0.12～0.16，但基因表達量為內參基因的2.26～9.14倍；而品系13、14、19、17病情指數介于0.46～0.57之間，其基因表達量僅為內參基因的1.19～1.79倍。表明，ATG3基因表達量≥1.8倍內參基因時，材料抗病性較好。

2.3.2ATG3基因表達量與抗病指數間的相關性 對ATG3基因表達規律與抗病指數間的關系進行研究，由表5可知，與HSP90基因類似，在線性分析與非線性分析條件下，在五～六葉期-葉、花期-花、角果期-15 d自交種子、角果期-25 d自交種子、角果期-35 d自交種子中均達極顯著負相關，且非線性相關性更高(五～六葉期除外)。對有顯著差異的材料作進一步分析，結果表明，五～六葉期-葉、花期-花的4種擬合函數R2均較小(表6)，與表5結果一致，表明本試驗數據可靠。

表5 ATG3基因表達規律與抗病指數相關性Table 5 Correlation between ATG3 gene expression pattern and disease resistance index

表6 ATG3基因表達規律與抗病指數間顯著差異材料相關性擬合模型Table 6 Correlation fitting model of significant difference material between ATG3 gene and disease index

2.4 HSP90與ATG3基因表達量與病害間的關系

分別選擇HSP90、ATG3基因與抗病指數有顯著或極顯著相關性的早期生育期，即HSP90選擇蕾薹期-葉和花期-葉，ATG3選擇五～六葉期-葉和花期-花進行綜合分析，結果表明，蕾薹期-葉中，有15個品系(除品系3、4、6、12、18)HSP90表達量與病情指數變規律相符，占總品系數的75%；花期-葉中有19個(除品系4)相符，占總品系數的95%，即用HSP90基因在花期-葉中表達量≥1.5倍內參時進行抗病品系篩選，有95%的準確性；ATG3基因在五～六葉期-葉與花期-花中，均有16個品系(前者除品系3、4、9、16，后者除品系1、4、7、10)的ATG3基因表達量與病情指數變規律相符，占總品系數的80%，即用ATG3基因在五～六葉期-葉或花期-葉中表達量≥1.8倍內參時進行抗病材料篩選，均有80%的準確性,因油菜花較難提取RNA，同時五～六葉期-葉在油菜生長發育前期，因而可選擇五～六葉期-葉進行篩選。

3 討論

大量研究表明，HSP90和ATG3基因在植物抗逆性中起著重要作用[17-22]。本研究對HSP90和ATG3基因在20個不同甘藍型高油酸油菜品系不同生育期材料中表達規律進行研究，發現二者在花期-葉與花期-花中的表達量均無顯著差異，其原因可能與花期營養生長與生殖生長均較旺盛相關[30]。而在角果期，二者均呈2種表達趨勢，即逐漸升高和先升高后降低趨勢，表明基因表達可能與不同材料有關，但仍需進一步驗證。此外，角果期是病害高發期[27]，本研究發現整個角果期HSP90和ATG3表達規律與抗病指數均呈極顯著負相關性，驗證了其抗病功能，與前人研究一致。

研究表明，利用抗病基因篩選抗病材料或進行病害防治能極大縮短時間，降低成本[31-32]。如Niu等[12]通過RT-qPCR驗證了9個抗病相關基因與小麥白粉病抗性相關，且其中8個基因與小麥白粉病抗性呈正相關；黃啟秀等[13]以7種海島棉為試驗材料，發現其枯萎病抗性與類黃酮代謝途徑基因CHI和DFR表達量呈顯著負相關性；谷曉娜等[14]以轉基因大豆N29-705-15和JL30-187為試驗材料，利用RT-qPCR技術檢測了hrpZpsta基因在轉基因大豆不同組織中的表達量，結果表明hrpZpsta基因在大豆植株中的表達量與受體植株對疫霉根腐病和灰斑病抗性存在一定的相關性。Barkley等[33-34]利用RT-qPCR方法，對高油酸花生及其野生型種子和葉片中的差異ahFAD2B基因進行檢測，快速區分了野生型和突變型，并進一步確定了ahFAD2A的不同突變類型；杜建中等[35]研究RDVMP基因在轉基因抗矮花葉病玉米的遺傳、表達及抗病性，結果顯示該基因的表達量與轉化株系的抗病性顯著相關。本研究通過RT-qPCR發現高油酸油菜抗病基因HSP90與ATG3分別在蕾薹期-葉、花期-葉與五～六葉期-葉、花期-花中的表達量與抗病指數呈極顯著正相關，且兩兩之間符合度均較高(60%～80%)。尤其是HSP90在花期-葉中表達量與ATG3在五～六葉期-葉表達量，符合度最高，可用于高油酸油菜抗病材料的早期篩選。

4 結論

本研究結果表明，HSP90基因在整個苗期表達量逐漸降低，ATG3基因則在苗期表達量逐漸升高，而角果期二者均呈2種表達趨勢，即逐漸升高和先升高后降低趨勢，表明基因表達可能與材料不同有關，可增加樣本量進一步檢測并開展相關基因后續功能驗證。發病率與病情指數相關性分析表明，油菜角果期HSP90和ATG3基因的表達規律與抗病指數之間呈顯著或極顯著負相關性。綜合兩基因表達情況結合病情指數分析可知，HSP90在花期-葉(95%)中表達情況與ATG3在五～六葉期-葉(80%)、花期-花(80%)中表達情況可用于高油酸油菜育種材料抗病性預測。本研究結果為高油酸油菜抗病材料的早期篩選和促進高油酸油菜育種研究奠定了一定的理論基礎。