楊梅酒對小鼠腹瀉的防治作用及其作用機理

戴凱群 齊莉莉,* 王進波 宋玉勝

(1 浙江大學寧波理工學院，浙江 寧波 315100； 2 寧波聚卿舫食品有限公司，浙江 寧波 315029)

楊梅[Myricarubra(Lour.) S. et Zucc. ]是我國江南特有水果，其風味獨特，富含有機酸、氨基酸、礦物質等營養成分，還有豐富的多酚、花色苷、類黃酮等活性成分，具有很高的營養價值和藥用價值[1-2]。研究表明，楊梅中的活性成分具有抗菌消炎[3-4]、抗氧化[5]、抑制腫瘤生長[6-7]、防止DNA損傷[8]、控制肥胖[9]、調節機體糖和脂肪代謝[10-13]等多種生物學功能。

由于新鮮楊梅不易貯藏，故民間一直有用燒酒浸楊梅果的傳統，浸楊梅果后的燒酒稱為“楊梅酒”，其中的楊梅果則稱“酒浸楊梅”。《本草綱目》記載“楊梅味酸甜，性溫、無毒。能止渴、和五臟、滌腸胃，除煩潰惡氣”。《開寶本草》記載，楊梅“主去痰、止嘔、斷下痢”。楊梅酒對腹瀉、痢疾等腸道疾病療效顯著，民間常用其止瀉。Yao等[14]用楊梅提取物飼喂模型小鼠，發現楊梅中的類黃酮能夠顯著抑制小鼠腹瀉。此外，楊梅酒對小鼠腹瀉也具有明顯的防治作用，其乙酸乙酯提取物和水提物均具有顯著的抑菌效果[15-16]。近年來抗生素的濫用使得細菌耐藥性不斷增強，甚至出現了具有超強耐藥性的超級細菌，這給腹瀉、痢疾等感染性疾病的防控帶來了巨大挑戰[17-18]。若能通過研發楊梅酒活性成分開發出抗生素藥物的替代品，具有十分廣闊的應用前景。本研究首先對楊梅酒的體外抗菌效果進行分析評價，然后以不同溶劑萃取楊梅中的活性成分，結合小鼠體內試驗分析其抗菌效果，并利用Western Blotting、ELISA等技術探討楊梅酒活性提取物對細胞NF-κB信號通路及炎癥因子表達的影響，以期闡釋楊梅酒防治腹瀉的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮楊梅購自浙江慈溪農貿市場；高粱燒(52% vol)購自慈溪市和豐酒業有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；IL-8、TNF-α、NF-κB和β-actin等抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；丙烯酰胺凝膠儲液、Loading Buffer(6×)、硝酸纖維素薄膜(0.45 μm)等購自北京索萊寶科技有限公司；TNF-α、IL-8 酶聯免疫試劑盒購自杭州聯科生物科技股份有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由浙江大學寧波理工學院腸道微生態與免疫實驗室保存；Balb/C小鼠購自浙江省醫學科學院[實驗動物生產許可證號：SYXK(浙)2014-0008]。其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

RV10DS96真空旋轉蒸發儀，德國IKA公司；Synergy H1全功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；TE2000-S熒光倒置顯微鏡，日本尼康株式會社；G154DS型壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；Chemidoc XRS凝膠成像儀、Turbo轉膜儀、Mini垂直板電泳儀，美國伯樂生命醫學儀器有限公司；Libra紫外可見分光光度計，英國柏楉有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 楊梅酒的制備 按照聶榮等[19]的方法并略作修改。楊梅果肉與高粱燒的比例為3∶5 g·mL-1，將楊梅果浸泡于高粱燒中，放置60 d后即得楊梅酒。

1.3.2 楊梅酒體外抑菌試驗 采用生長曲線法，將高粱燒或楊梅酒與經滅菌的LB液體培養基按照體積比1∶9混合均勻。取上述混合好的LB液體培養基100 mL，分別加入5 mL過夜培養的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌懸液，37℃恒溫搖床(250 r·min-1)培養。分別于培養0、1.5、3、4、5、6、8、10、12 h取樣，測定細菌培養液在600 nm波長處的吸光度值，分析楊梅酒對細菌生長、增殖的影響。

1.3.3 楊梅酒活性成分的分級提取 高粱燒浸泡楊梅用高速勻漿器搗碎，與楊梅酒一起旋轉蒸發，除去乙醇，然后5 000 r·min-1離心15 min，取適量上清液分別用等體積乙醚、乙酸乙酯連續萃取6 h，每種溶劑反復萃取3次，合并相同有機相萃取物，經旋轉蒸發除去溶劑，即得萃取物。不同萃取劑提取的楊梅酒活性成分萃取物依次為無水乙醚相萃取物(ethyl ether extract, EEE)、乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extract, EACE)及水相提取物(water extract, WE)。

1.3.4 楊梅酒活性成分萃取物的體外抑菌試驗 將3種分級提取物與雙蒸水按照5∶1 g·mL-1混合，采用管碟法進行體外抑菌試驗，以楊梅酒原液為對照，測定3種分級產物的抑菌活性。取200 μL菌液，均勻涂布于LB固體平板上，每個平板等距離放置3個滅菌牛津杯(內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm)，然后分別吸取3種分級提取物水溶液各200 μL加入牛津杯，每種提取物進行3個平行試驗，以無菌生理鹽水為陰性對照，卡那霉素(50 μg·mL-1)為陽性對照。將牛津杯置于37℃恒溫培養箱中培養24 h后，量取抑菌圈直徑并記錄。

1.3.5 楊梅酒活性成分萃取物的動物試驗 選健康BALB/c小鼠，禁食12 h后，按照每10 g體重0.2 mL致病性大腸桿菌懸液(109CFU·mL-1)，施行腹腔注射，注射后觀察小鼠排便狀況，持續觀察6 h，小鼠每小時排稀便一次以上，則為腹瀉造模成功。試驗期間小鼠自由進食。

選取造模成功的小鼠48只，隨機分為6組，每組8只，雌雄各半，單只單籠飼養，籠內墊有濾紙，每小時換一次。楊梅酒乙醚萃取物(EEE)、乙酸乙酯萃取物(EACE)、水相提取物(WE)與無菌水以5∶1 g·mL-1的比例混合。模型小鼠分別灌喂生理鹽水、楊梅酒、高粱燒、EEE、EACE及WE各2 mL·次-1，每隔2 h灌服1次，記錄各處理組小鼠灌服后6 h的腹瀉總次數。

1.3.6 HT-29細胞的處理 以HT-29細胞為腸道粘膜上皮細胞模型，在37℃、5%二氧化碳條件下，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基進行培養。EACE溶解于RPMI-1640培養基中，得EACE濃度分別為0、1.0、5.0、10.0 mg·mL-1含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。待細胞長至細胞瓶底面積70%時，細胞傳代、接種至六孔板上。待細胞長至六孔板80%，用上述濃度梯度的培養基分別處理細胞12 h。

1.3.7 Western Blotting分析 HT-29細胞經EACE處理培養12 h后，吸棄培養基，然后用生理鹽水洗滌細胞3次，提取細胞中的總蛋白質，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠濃度12.5%)分離蛋白質條帶，然后100 V Turbo半干式轉膜2 h，再用TBS-T洗膜，室溫脫脂奶粉封閉2 h后進行一抗(IL-8、TNF-α、NF-κB、β-actin)、二抗的孵育，膜上加入ECL顯色液，避光顯色5 min后放入化學發光儀中成像。采用BandScan 5.0軟件計算灰度值，目的蛋白與β-actin灰度比值即為目標蛋白的相對表達量。

1.3.8 ELISA分析 采用雙抗體夾心法，按照杭州聯科生物技術股份有限公司提供的檢測方法進行檢測。細胞培養液上清液以300× g離心力離心10 min去除沉淀物，設為待測液。96孔板中每孔加入80 μL檢測緩沖液和20 μL待測液，然后每孔加入50 μL稀釋的檢測抗體，應用封板膜封板，室溫下300 r·min-1振蕩孵育2 h。棄去前面加入的液體，每孔加入300 μL洗液洗板每次洗板，在吸水紙上拍干，洗滌6次；每孔加入100 μL稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素并使用新的封板膜封板，然后室溫下300 r·min-1振蕩孵育45 min，再于每孔加入100 μL顯色底物，避光室溫孵育 5～30 min后每孔加入100 μL終止液，最后用全功能酶標儀測定其雙波長(450 nm和630 nm)下的吸光度值。

1.3.9 數據處理 采用Microsoft Excel 2007 軟件和 SPSS 18.0軟件對試驗數據進行統計分析。所有數據均以均數±標準差(SD)表示。采用單因素ANOVA方差分析對不同劑量組間與對照組試驗數據進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 楊梅酒對細菌生長增殖的影響

由圖1-A可知，與對照組(生理鹽水)相比，高粱燒對大腸桿菌的生長增殖幾乎沒有影響，而等量的楊梅酒則顯著抑制了大腸桿菌的生長增殖(P<0.05)。由圖1-B可知，在處理3～5 h的楊梅酒和高粱燒均能抑制金黃色葡萄球菌的生長增殖(P<0.05)，發揮抑菌作用；處理5 h后，楊梅酒仍具有較好的抑菌效果，而高粱燒則失去抑菌作用。由圖1-c可知，0～8 h內，高粱燒能夠顯著抑制枯草芽孢桿菌生長增殖(P<0.05)，8 h后抑菌作用消失，細菌快速生長，這可能是因為乙醇被揮發或消耗了；楊梅酒則能夠發揮持續抑菌作用，在8～12h其抑菌效果顯著好于高粱燒(P<0.05)。綜上表明，楊梅酒對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長增殖均具有明顯的抑制作用，其抑菌效果明顯好于等量的高粱燒，說明楊梅酒的抑菌作用與楊梅中浸出的活性成分密切相關，而不僅是酒精發揮了抑菌作用。

2.2 楊梅酒活性成分萃取物的抑菌作用

由表1可知， EACE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均產生明顯的抑菌圈，表現出較強的抑菌活性，且對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活性明顯高于楊梅酒、WE和陽性對照組。WE也對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌活性，其中，對枯草芽孢桿菌的抑菌活性最強。但EEE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等均無抑菌活性。綜上，EACE的抑菌活性最強，說明乙酸乙酯對楊梅中抑菌活性成分的提取效率較高。

注：A、B、C分別表示大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A, B and C indicate E.coli, S.aureus, and B. subtilis, respectively. Different lowercase letters in the different graoups mean significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 楊梅酒對不同細菌生長增殖的影響Fig.1 Effects of Chinese bayberry wine on the growth and proliferation of bacteria

表1 楊梅酒不同活性成分萃取物的抑菌圈直徑Table 1 The antibacterial circle diameters of different extracts from Chinese bayberry wine /mm

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；“ND”表示無抑菌圈。

Note: Different lowercase letters in the same line mean significant difference at 0.05 level. ‘ND’ means no antibacterial circle.

2.3 楊梅不同活性成分萃取物對小鼠腹瀉的防治作用

由圖2可知，灌胃、高粱燒、楊梅酒、WE和EACE的小鼠腹瀉狀況明顯緩解，而EEE對小鼠的腹瀉無明顯緩解作用，說明楊梅乙酸乙酯萃取物EACE防治小鼠腹瀉的效果較好。

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。Note: Different capital letters indicate extremely significant difference at 0.01 level. The same as following.圖2 楊梅不同活性萃取物對小鼠腹瀉次數的影響Fig.2 Effect of different active extracts from Chinese bayberry wine on the diarrhea times of mice

2.4 EACE對HT-29細胞炎癥因子表達與分泌水平的影響

由圖3可知，隨著EACE濃度的增加， IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達水平逐漸下降， NF-κB(p65)亞基的表達量也呈下降趨勢。ELISA分析結果與Western Blotting結果一致(圖4)，EACE處理能夠降低細胞培養液中IL-8、TNF-α等炎癥因子的水平，說明楊梅活性萃取物EACE的成分可能通過抑制 NF-κB信號通路的激活，降低炎癥因子的表達，進而發揮抗腹瀉作用。

圖3 EACE對小鼠腹瀉炎癥因子表達水平的影響Fig.3 Effect of EACE on the expression of mouse diarrhea related inflammatory factors

圖4 EACE對細胞培養液中炎癥因子濃度的影響Fig.4 Effect of EACE on the levels of inflammatory factors in the cell culture

3 討論

本研究結果表明，楊梅酒的抑菌效果明顯優于高粱燒；楊梅酒能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長增殖，這與秦紅等[20]研究楊梅酒對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌等腸道菌抑制作用的結果一致。高粱燒等中國白酒含有多種活性成分，具有抑菌消炎作用[21]。本研究中，高粱燒浸泡楊梅所得楊梅酒的抑菌活性高于高粱燒，表明楊梅中的活性成分也發揮了抑菌作用。為了進一步探究楊梅酒中的抑菌活性成分，本研究以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為代表菌株，比較楊梅酒乙酸乙酯萃取物(EACE)、水提物(WE)和乙醚萃取物(EEE)的抑菌活性，發現EACE抑菌活性最高，WE次之，EEE幾乎無抑菌活性，這與Li等[3]的研究結果一致。楊梅酒活性萃取物的抑菌活性與其中的類黃酮、多酚等成分有關，萃取溶劑的性質不同，其萃取物的組分就不相同，這些組分的抑菌能力存在很大差異，其預防和治療腸炎、腹瀉的效果也顯著不同。在體外抑菌試驗的基礎上，本研究以腹瀉小鼠為模型進行動物試驗，結果表明，楊梅酒EACE和WE均具有治療小鼠腹瀉作用，而EEE對小鼠腹瀉無任何防治作用，這與Yao等[14]的研究結果一致。

NF-κB是哺乳動物細胞內重要的轉錄因子，由p50和p65兩個亞基組成。細胞受到炎癥信號刺激后，該因子的表達水平上升[22-24]，進而上調其下游TNF-α、IL-8等促炎癥因子的表達，這些因子的表達和釋放能夠引起強烈的腸道炎癥反應[25-27]。為深入解析楊梅酒防治腹瀉的機制，本研究以HT-29腸粘膜上皮細胞為模型，探究抑菌活性最強的EACE對TNF-α、IL-8表達和分泌的影響，發現EACE能夠顯著降低TNF-α和IL-8的水平，這與Guo等[28]發現楊梅提取物能夠降低人血液中TNF-α和IL-8水平的結果相似，表明楊梅中的活性物質能夠通過抑制TNF-α等炎癥因子的表達，進而防治腹瀉。本研究中，楊梅酒EACE能夠抑制p65亞基的表達，表明楊梅酒中的活性成分可能通過下調 NF-κB信號通路，抑制TNF-α和IL-8等炎癥因子的表達，進而發揮消炎、抗腹瀉作用。

4 結論

楊梅酒對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等腸道致病菌均具有較強的抑菌作用，其抑菌效果好于高粱燒；楊梅酒能夠顯著降低腹瀉模型小鼠腹瀉次數，明顯防治小鼠腹瀉。楊梅酒乙酸乙酯萃取物(EACE)抑菌活性最高，水提物(WE)次之，乙醚提取物(EEE)則無抑菌作用。楊梅EACE具有很強的防治小鼠腹瀉的作用，其效果優于楊梅酒和高粱燒；楊梅酒EACE可通過抑制腸道NF-κB信號通路的活性，降低腸道上皮細胞TNF-α、IL-8等炎癥因子的表達水平，從而發揮生理活性作用。今后可利用色譜分離、質譜鑒定等方法對楊梅EACE的組分進行分離、鑒定并解析其結構，進一步明確楊梅酒中EACE的防治腹瀉的活性物質成分。