褐藻糖膠對黃顙魚幼魚中脂肪酸的影響

趙 倩 鐘 琪 徐盼盼,* 陳娟娟 楊 銳

(1 寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211； 2 寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)屬硬骨魚綱(Ostei-chthyes)鲇形目(Siluriformes) 鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(Pelteobagrus)，是一種廣泛分布于我國長江、黃河、珠江等流域的小型經濟魚類，其肉質細嫩、細刺較少、無鱗片，備受消費者青睞。此外，黃顙魚還具有較高的藥用價值，如從其體表黏液中可以分離得到一種新型的抗菌肽[1-2]，促使黃顙魚的市場需求量日益增加。黃顙魚魚體內脂肪含量較少，多由不飽和脂肪酸組成，人體吸收率高達95%，具有很高的食用價值[3-5]。脂肪含量是指示魚體生理變化的指標之一，因此在魚類養殖過程中人們在投喂的飼料中添加含有增加脂肪的成分[6-7]，但過量使用這些飼料會導致魚體內脂肪積累過載，進而使黃顙魚的食用價值下降，嚴重時甚至會使魚患脂肪肝，造成魚體抗病力下降[8-9]。因此，如何進行高效、高質量的黃顙魚養殖受到人們廣泛關注[10]。

褐藻糖膠是以小滴狀存在于褐藻細胞間組織或黏液基質中的一種水溶性雜多糖，廣泛分布于褐藻和無脊椎動物中，其主要成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯[11-12]。由于天然硫酸基存在于其分子鏈末端，褐藻糖膠表現出特殊的生理活性[13-14]，如抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降血脂、調節免疫系統、抗氧化等[15-18]。同時，研究發現褐藻糖膠可促進腸胃蠕動，加速腸道內多余膽固醇及有害物質(尤其是重金屬)的排出，還具有降低甘油三酯和膽固醇含量的功效，且對肝臟無毒害的作用[19]。此外，褐藻糖膠已被證實可以調節脂質代謝[20]，主要是抑制外源性脂質吸收，促進內源性脂質代謝和增加膽汁酸的排泄。研究表明，褐藻糖膠可以通過激活血清和肝臟中的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、肝脂酶(hepatic lipase，HL)活性來降低血清甘油三酯，激活卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(lecithin cholesterol acyl transferase，LCAT)降低血清膽固醇；同時，褐藻糖膠可顯著增強高脂血癥大鼠肝臟LDL-RmRNA的表達，促進低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)的清除，達到有效降低血清膽固醇的作用[21-22]。此外，褐藻糖膠還具有調控脂質代謝的功能[23]。脂肪由一系列的脂肪酸組成。脂肪酸是魚類生長發育過程中必需的能量和營養物質之一，其種類豐富，數量繁多[24-25]。脂肪酸有助于魚體內脂溶性維生素的吸收和運輸，且部分高不飽和脂肪酸還具有神經傳導和信息傳遞等功效。但關于褐藻糖膠對魚類脂肪酸的影響尚未見報道，因此，在黃顙魚脂質代謝基礎上，深入了解投喂褐藻糖膠對黃顙魚幼魚體內的脂肪酸組成變化的影響，對監控黃顙魚養殖質量和開發功能型飼料添加劑方面具有重要的意義。本研究采用氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析在喂養0.1%褐藻糖膠第1、第2、第4和第8周時黃顙魚幼魚的脂肪酸組成和含量的變化情況，以期為黃顙魚的健康養殖提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼養兩周的健康黃顙魚幼魚購自浙江嘉興一星公司養殖基地。脂肪酸標準品十九烷酸(C19：0)購自美國Sigma試劑公司；正己烷(色譜級)購自美國TEDIA公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

QP-2010氣相色譜質譜聯用分析儀，日本SHIMADZU公司；SPB-50色譜柱，美國Supelco公司;DC-12氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；RV/O旋轉蒸發儀，德國IKA集團公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 喂養試驗 經過攝食訓化后，選用空腹24 h，平均體重為40.8±0.60 g的健康黃顙魚幼魚進行試驗，將其隨機抽取并分為試驗組(F組)和對照組(C組)兩組，每組各設5個重復，每個重復為30尾，然后以重復為單位分別飼養在體積為500 L的圓柱形塑料桶中。試驗期間，水溫為26～31℃、pH值為7.5～7.8，氨氮濃度不高于0.05 mg·L-1，試驗用水為經過曝氣處理的自來水，整個養殖過程中連續充氣，速率為1 L·min-1，溶氧濃度保持或接近飽和。每2周測量1次體重，每天投喂2次，日投喂量為其體重的6%～8%，投喂時間為07:00、17:00，投喂后1 h觀察其攝食情況，根據魚的進食情況調整投喂量。每天除污1次，前2周隔天換水1次，之后視水質情況每天換水40%～60%。對照組飼喂普通飼料，試驗組飼喂添加0.1%褐藻糖膠的飼料，試驗共進行8周，分別于喂養第1、第2、第4、第8周時取樣，每個投喂時間點分別在各組中取出10尾，作為10個平行。經超低溫冷凍干燥后，進行液氮冰浴研磨，然后置于-80℃冰箱保存備用[20]。

1.3.2 總脂肪酸的測定 取50 mg全魚樣品置于4 mL樣品瓶中，然后加入1 mL正己烷、1.2 mL甲酰氯(甲醇/乙酰氯，9∶1，v/v，現用現配)及15 μL 1 μg·μL-1的內標物(C19：0)，持續振蕩1 min，70℃水浴2 h，冷卻15 min后移入15 mL玻璃離心管中，再加入2.5 mL 6% K2CO3和1 mL正己烷，振蕩30 s后于 3 000 r·min-1條件下離心10 min，保留上清液。取上清液于4 mL樣品瓶中，25～30℃旋蒸至恒重，N2吹干，于-20℃冰箱中保存。

脂肪酸提取液在分析前用2 mL正己烷(色譜純)復溶，并于12 000 r·min-1條件下離心10 min，再用0.22 μm有機濾膜過濾。

色譜條件：采用SPB-50石英毛細管柱，規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm(Supelco，USA)。進樣口溫度250℃，載氣為99.999%的高純氦氣，柱流速0.81 cm3·min-1，柱前壓7.3×10-2MPa，柱起始溫度為150℃，保持3.5 min，以20℃·min-1的升溫速率升至200℃，保持5 min，再以5℃·min-1的升溫速率升至280℃，保持20 min。分流進樣，進樣量為1 μL，分流比為50∶1。

質譜條件：EI源分析，選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式，離子源溫度200℃，接口溫度250℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍為m/z 50～650，溶劑延遲時間為3 min。

1.3.3 游離脂肪酸的測定 參考Küpper等[26]和Su等[27]的方法。取15 mL離心管，加入6 mL乙酸乙酯，再加入100 mg全魚樣品，持續振蕩2 min，然后58 kHz功率下超聲5 min后于4℃下搖晃1 h，在3 500 r·min-1條件下冷凍(4℃)離心15 min，保留上清液；殘渣(沉淀)加入4 mL乙酸乙酯按上述步驟重復提取2次，合并上清液。取上清液于50 mL離心管中，加入5 mL冰水，于4℃條件下3 500 r·min-1離心15 min；取有機相于4 mL樣品瓶中，35℃旋蒸至恒重，加入30 μL 1 μg·μL-1內標物(C19：0)、200 μL乙腈、40 μL二異丙基乙胺及20 μL 2,3,4,5,6-五氟芐基溴，35℃水浴30 min，并采用N2吹干，-70℃保存。

游離脂肪酸提取液分析前用500 μL正己烷復溶，并于12 000 r·min-1條件下離心10 min，再用0.22 μm有機濾膜過濾。

色譜條件：采用規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm(Supelco，USA)的SPB-50MS柱，進樣口溫度250℃，載氣為99.999%的高純氦，總流速20 mL·min-1，柱流速0.62 mL·min-1，柱前壓5.16×10-2MPa，采用程序升溫模式，起始溫度150℃，保持3.5 min然后以 20℃·min-1的升溫速率升至200℃并保持5 min，再以 5℃·min-1的升溫速率升至280℃，保持18 min，不分流進樣方式，進樣量為1 μL。

質譜條件：采用NCI源分析，選取全程離子碎片掃描模式，以甲烷為反應氣。離子源溫度200℃，接口溫度250℃，質量掃描范圍為m/z 50～750，溶劑延遲時間3 min。

1.4 數據處理

脂肪酸的定性及半定量方法：在總離子色譜圖(totalion chromatogram, TIC)中，首先確定各物質的分子量，再將其在相應的離子碎片質量譜圖與NIST14L庫和WILEY庫中的進行檢索比對，確定脂肪酸的種類。通過脂肪酸與已知濃度內標(C19：0)的面積之比對各個脂肪酸進行半定量分析，計算各脂肪酸的含量。

試驗數據均以平均值 ± 標準差表示，采用Microsoft Excel 2010 軟件進行數據的初步整理，再采用 SPSS 17.0統計軟件進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黃顙魚幼魚脂肪酸定性定量分析方法的建立

總脂肪酸和游離脂肪酸揮發性物質通過氣相色譜-質譜聯用技術進行定性定量分析，總脂肪酸-總離子流圖(TFA-TIC)和游離脂肪酸-總離子流圖(FFA-TIC)如圖1所示。定性依據之一是相對保留時間，即tR總脂肪酸/tRC19：0，其次是，將總脂肪酸各個組分的質譜圖分子離子峰和碎片離子峰與脂肪酸標準譜圖(NIST庫)進行比較檢索脂肪酸。游離脂肪酸在衍生化過程中，與PFBBr酯化反應得到衍生化產物脂肪酸五氟苯甲酯[FA-PFBME]，通過NCI 源獲得質譜信息，失去五氟苯甲基得到碎片離子[M-PFB]-，該離子在質譜圖中豐度最高，確定分子量并完成定性分析。以C19：0作為內標化合物，通過各個脂肪酸的峰面積與C19：0峰面積的比值進行半定量分析，由此計算出各組分在樣品中的相對含量。

圖1 黃顙魚總脂肪酸和游離脂肪酸的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of total fatty acids and free fatty acids in P. fulvidraco

2.2 褐藻糖膠對黃顙魚總脂肪酸組分的影響

由表1可知，在0.1%褐藻糖膠投喂期間黃顙魚幼魚體內共檢測到15種總脂肪酸，主要的脂肪酸為C16：0、C18：0、C18：1 (n-9)、C18：2 (n-6)和C22：6 (n-3)，占總脂肪酸的70%～80%。其中飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)包括C14：0、C15：0、C16：0、C17：0和C18：0，單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)包括C16：1 (n-7)、C18：1 (n-9)、C18：1 (n-7)和C20：1 (n-9)，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)包括C18：2 (n-6)、C18：3 (n-3)、C20：2 (n-6)、C20：4 (n-5)、C20：5 (n-3)和C22：6 (n-3)。喂養時間對黃顙魚幼魚總脂肪酸[C18：3(n-3)除外]具有顯著性影響(P<0.05)，而0.1%褐藻糖膠對黃顙魚幼魚大部分總脂肪酸無顯著影響，而C組與F組中黃顙魚幼魚C18：1 (n-9)、C20：4(n-5)和C22：6(n-3)含量差異顯著(P<0.05)，且喂養時間與投喂0.1%褐藻糖膠具有交互作用。

由圖2可知，隨著喂養時間的延長，C組和F組中黃顙魚幼魚的SFAs含量呈現先升高后下降的趨勢。MUFA中C16：1(n-7)、C18：1 (n-9)含量在C組和F組中均呈先升高后下降的趨勢；C18：1 (n-7)含量在F組中基本保持不變，而在C組中呈現下降趨勢；C20：1(n-9)含量在C組和F組中均呈現逐漸上升趨勢。而PUFA中的C18：2 (n-6)、C18：3 (n-3)和C20：2 (n-6)含量在C組和F組中的變化趨勢表現為先降低后升高，C20：4(n-5)、C20：5 (n-3)和C22：6 (n-3)含量則逐漸降低。此外，在喂養第8周時，F組中具有交互作用的總脂肪酸C18：1 (n-9)、C20：4(n-5)和C22：6 (n-3)含量顯著高于C組(P<0.05)，分別為C組的1.06倍、1.12倍和1.09倍。

表1 喂養時間、褐藻糖膠及兩者交互作用對黃顙魚幼魚脂肪酸影響的差異性分析Table 1 Difference analysis of feeding time, fucoidan and their interaction on effect of fatty acids in juvenile P. fulvidraco

表1(續)

注:“-”表示未檢出。

Note: ‘-’means not detected．

注：不同小寫字母表示不同喂養時間下C組差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同喂養時間下F組差異顯著(P<0.05)。差異變化一致時僅用小寫字母標識。*表示相同喂養時間點下C組與F組差異顯著(P<0.05)。下同。Note：Different lowercase letters mean significant difference in C group with different feeding time (P<0.05). Different capital letters mean significant difference in F group with different feeding time (P<0.05). * means the significant difference between C and F groups under the same feeding time (P<0.05). The same as following.圖2 褐藻糖膠對黃顙魚幼魚中總脂肪酸組分及含量的影響Fig.2 Effect of fucoidan on composition and content of total fatty acid in juvenile P. fulvidraco

圖3 褐藻糖膠對黃顙魚幼魚中游離脂肪酸組分及含量的影響Fig.3 Effect of fucoidan on composition and content of free fatty acid in juvenile P. fulvidraco

2.3 褐藻糖膠對黃顙魚游離脂肪酸組分的影響

不同喂養時間下C組和F組黃顙魚幼魚樣品中共檢測到的17種FFA(表1)，其中SFA包括C14：0、C15：0、C16：0、C17：0和C18：0，MUFA包括[C16：1(n-7)、C17：1(n-6)、C18：1(n-7)、C18：1(n-9)和C20：1(n-9)]，PUFA包括C16：2(n-7)、C18：2(n-6)、C18：3(n-3)、C20：2(n-6)、C20：4(n-5)、C20：5(n-3)和C22：6(n-3)，主要游離脂肪酸為C16：0、C16：1(n-7)、C18：0、C18：1(n-9)和C18：2(n-6)占總游離脂肪酸的70%～80%。除C16：2(n-7)、C20：1(n-9)和C20：5(n-3)外，喂養時間與0.1%褐藻糖膠處理對其他游離脂肪酸組分均具有交互作用，且喂養時間和0.1%褐藻糖膠處理對黃顙魚幼魚游離脂肪酸具有顯著性影響(P<0.05)。

由圖3可知，隨著喂養時間的延長，F組黃顙魚幼魚SFA含量呈現先增加后減少的趨勢，其中C16：0、C17：0和C18：0含量先增加后減少，C14：0和C15：0含量則逐漸下降。F組黃顙魚幼魚中SFA出現增高現象，特別在喂養第2和第4周，其SFA含量分別是為C組的1.09倍和1.10倍。隨著喂養時間的延長，C組和F組中MUFA含量也呈先減少后增加的趨勢，且F組中MUFA含量均低于C組，尤其在喂養第8周時，F組黃顙魚幼魚中C16：1(n-7)、C17：1(n-6)和C18：1(n-7)含量顯著低于C組(P<0.05)，C18：1(n-9)則在喂養第2周時顯著低于C組(P<0.05)。隨著喂養時間的延長，黃顙魚幼魚中PUFA的不同組分呈現不同的變化趨勢，其中不飽和度低于3且具有交互作用的PUFA有C18：2(n-6)、C18：3(n-3)和C20：2(n-6)。隨著喂養時間的延長，F組黃顙魚幼魚中C18：2(n-6)、C18：3(n-3)和C20：2(n-6)含量逐漸下降，且在喂養第8周仍低于或者等于喂養第1周；C組黃顙魚幼魚中C18：2(n-6)、C18：3(n-3)和C20：2(n-6)含量逐漸下降，在喂養第2或第4周降到最低值，但在喂養第8周時三者含量升高，且高于喂養第1周。此外，在喂養第8周時，F組黃顙魚幼魚中C18：2(n-6)、C18：3(n-3)和C20：2(n-6)含量均顯著低于C組(P<0.05)。不飽和度高于3且具有交互作用的游離脂肪酸有C20：4(n-5)和C22：6(n-3)。隨著喂養時間的延長，C組黃顙魚幼魚中C20：4(n-5)和C22：6(n-3)含量先增加后減少，分別在喂養第2和第4周達到最大值；F組中C20：4(n-5)含量變化不一，總體呈現下降趨勢，C22：6(n-3)含量在喂養第1～4周基本無變化，但在喂養第8周顯著上升(P<0.05)。此外，在喂養第1和第2周時，C組C20：4(n-5)和C22：6(n-3)含量與F組差異不顯著，在喂養第4和第8周時，F組中C20：4(n-5)含量顯著高于C組(P<0.05)，喂養第4周時，C組中C22：6(n-3)含量顯著高于F組，喂養第8周時其含量則顯著低于F組(P<0.05)。

3 討論

Yang等[28]發現褐藻糖膠對黃顙魚幼魚的血液特性、抗氧化狀態和非特異性免疫反應有顯著影響，與喂養不含褐藻糖膠的基礎飼料相比，喂養含褐藻糖膠飼料的黃顙魚幼魚中甘油三酯、總膽固醇、丙二醛和高密度脂蛋白含量顯著降低；楊晴等[29]通過對比不添加褐藻糖膠與添加自制褐藻糖膠和商品褐藻糖膠的飼料喂養黃顙魚的生長性能和消化酶活性，發現飼料中添加褐藻糖膠可顯著提高黃顙魚幼魚的終末體重、增重率和特定生長率(P<0.05)，同時，喂養添加自制褐藻糖膠的飼料后，黃顙魚幼魚腸道和胃中的脂肪酶活性均不同程度地增高，其中褐藻糖膠有效濃度為0.01%時，黃顙魚幼魚胃中脂肪酶活性顯著升高(P<0.05)，褐藻糖膠有效濃度為0.05%～0.20%時黃顙魚幼魚腸道中脂肪酶活性顯著升高(P<0.05)。此外，研究表明，經0.1%褐藻糖膠喂養的黃顙魚中Lyso-PC、PC、PI和PE含量在喂養第8周時均達到最大值，DAG含量呈現先減少后增加的變化規律，而TAG含量的變化不定，TAG 18：2/14：0/18：1、TAG 20：5/16：0/18：3和TAG 20：4/16：1/18：2含量隨著喂養時間的延長而增加，而TAG 16：0/18：2/20：5含量則逐漸減少[30]。隨著喂養時間的延長，黃顙魚幼魚脂質成分的含量發生變化，這可能是由于褐藻糖膠的調節，使得黃顙魚幼魚的免疫力得到提高。

脂肪酸不僅是魚類生長發育階段重要的代謝能源，而且是魚類機體內重要的內源性營養物質。本研究結果表明，黃顙魚幼魚SFA中C16：0含量最高，與文獻[31]報道一致，說明C16：0是一種基礎脂肪酸，具有為機體提供能量，并轉化成其他脂肪酸的功能。由于魚體內必需脂肪酸自身無法合成，只能通過喂養的飼料直接提供，C20：3(n-3)含量則作為魚體內PUFA是否缺乏的指標，當PUFA缺乏時，C18：1(n-9)通過去飽和并加長碳鏈數從而轉換成C20：3(n-3)[32]。研究表明，當C20：3(n-3)/C22：6(n-3)比值大于或者等于0.4時，魚體內則會出現缺乏必需脂肪酸的癥狀，從而會導致魚類的產卵量和孵化率降低[33]。本研究結果表明，C18：1(n-9)是黃顙魚體內主要的單不飽和脂肪酸，其中，隨著喂養時間的延長，游離脂肪酸C18：1(n-9)含量增加，但F組中C18：1(n-9)含量略低于C組，而總脂肪酸C18：1(n-9)含量呈先增加后下降趨勢，F組黃顙魚幼魚由于受到0.1%褐藻糖膠的影響，C18：1(n-9)含量在喂養第8周時顯著高于C組(P<0.05)。此外，C20：3(n-3)在游離脂肪酸和總脂肪酸中均未檢測到。而F組中游離脂肪酸C22：6(n-3)含量隨著喂養時間的延長而逐漸增加，整體上，F組總脂肪酸C22：6(n-3)含量高于C組。綜上，褐藻糖膠可能有益于黃顙魚產卵和孵化。

亞油酸C18：2(n-6)是n-6系列脂肪酸的前體，而α-亞麻酸C18：3(n-3)則是n-3系列脂肪酸的前體，兩者均由飲食提供，不能自身合成[34]。C18：2(n-6)和C18：3(n-3)可通過一系列的碳鏈延長和脫飽和作用等方式衍生生成其他的PUFA。本研究中，黃顙魚幼魚游離脂肪酸和總脂肪酸中C18：2(n-6)和C18：3(n-3)含量均呈先下降后升高的趨勢。F組游離脂肪酸中C18：3(n-3)含量明顯低于C組，喂養第4周前，F組中C18：2(n-6)含量高于C組，而喂養第8周時，其含量則顯著低于C組(P<0.05)，這可能是因為血液中的膽固醇與C18：2(n-6)可以結合生成酯，不會沉積于血管壁上，從而可以降低血脂。C18：2(n-6)可以維護細胞的柔性、強性和活性[35]。喂養第8周時F組中C18：2(n-6)含量下降且低于C組，這個現象與之前研究結果相符[30]。

C22：6(n-3)是仔魚的必需脂肪酸，不僅對于腦神經和視神經迅速發育起到關鍵作用[36]，而且在提高魚類性腺發育、排卵、孵化率及仔魚存活率方面發揮了重要作用[37]。本研究結果表明，喂養第8周時F組黃顙魚幼魚總脂肪酸和游離脂肪酸中C22：6(n-3)含量顯著高于C組(P<0.05)，說明褐藻糖膠可能有助于黃顙魚幼魚的發育生長。魚類生殖活動會消耗體內的C20：4(n-5)[38]，而在喂養第8周時，F組總脂肪酸和游離脂肪酸中C20：4(n-5)含量顯著高于C組(P<0.05)。因此，褐藻糖膠作為飼料添加劑有利于魚類生殖。

4 結論

本試驗利用GC-MS技術對0.1%褐藻糖膠喂養黃顙魚幼魚1～8周后脂肪酸的變化情況進行了研究，發現喂養時間對脂肪酸具有顯著性影響，隨著喂養時間的延長，黃顙魚幼魚總脂肪酸中C18：1(n-9)含量先升高后降低，而C20：4(n-5)和C22：6 (n-3)含量逐漸降低；游離脂肪酸中SFA含量先升高后降低，MUFA和PUFA含量則先降低后升高。0.1%褐藻糖膠對總脂肪酸含量無顯著性影響，但對游離脂肪酸含量具有顯著影響，其中脂肪酸C20：3(n-3)未檢出，C20：3(n-3)/C22：6(n-3)的比值小于0.4，且喂養第8周時F組中C22：6(n-3)和C20：4(n-5)含量顯著高于C組，說明褐藻糖膠不會降低黃顙魚產卵量和孵化率，且有助于黃顙魚幼魚的生長發育，具有作為魚類飼料添加劑的開發潛力。