干旱脅迫下H2S對板栗幼苗根系抗氧化特性及呼吸相關酶活性的影響

孫曉莉 田壽樂 沈廣寧,* 姜倩倩 許 林

(1 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2 濰坊學院生物與農業工程學院，山東 濰坊 261061)

植物生長過程中離不開水分，缺水會影響植物生長發育，減緩植物營養物質貯藏和蛋白質合成，導致產量降低。隨著全球氣候變暖，干旱日益成為限制作物優質高產的主要因子，因此，研究植物耐旱性具有重要意義。干旱導致土壤水分含量降低，而根系作為受土壤干旱脅迫最敏感的部位，其正常生理過程首先受到干擾[1]。干旱會抑制根系呼吸，影響呼吸代謝相關酶活性，導致根系吸收、運輸水分和養分等功能紊亂[2-3]。板栗(Castaneamollissima)原產自中國，是我國栽培最早的果樹樹種之一，也是重要的經濟林樹種，不僅可作為食物、木材、藥材等，還可涵養水分、防止水土流失、維持生物多樣性等。栽培栗樹可以開發干旱瘠薄的砂石山區，具有生態保護功能，但隨著山區水資源缺乏的問題日益突出[4]，干旱已成為限制板栗生產的主要土壤環境因子，是導致板栗減產的重要原因之一，尤其在板栗開花期與灌漿期[5]，因此探討板栗耐旱性具有重要意義。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三大內源性氣體信號分子。研究表明，高濃度H2S具有生物毒性，會導致葡萄、苜蓿、生菜等植物葉片脫落，抑制氧的釋放和磷等營養物質的吸收，減緩植物生長[6-7]；而生理濃度H2S可調節植物氣孔運動、延緩植物衰老、促進根系延伸、促進種子萌發、提高光合作用，增強植物對非生物脅迫(如鹽脅迫、干旱脅迫、溫度脅迫、重金屬脅迫、低氧脅迫等)的抗性[8-11]。H2S對植物生長發育的調控作用具有劑量效應。García-Mata等[12]研究表明，干旱脅迫下硫氫化鈉(NaHS)處理可以提高蠶豆和蘇丹鳳仙花的相對含水量并緩解植物受到的干旱損傷；Zhang等[13]研究表明，H2S可清除膜脂過氧化產生的過量活性氧(reuctive oxygen species, ROS)，降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，提高相關抗氧化酶活性，從而有效增強甘薯、大豆和擬南芥的抗旱能力；Jin等[14]研究表明，干旱脅迫下H2S處理能進一步刺激干旱相關L-CD/D-CD1基因的表達，提高擬南芥幼苗的存活率；劉晶等[15]發現干旱脅迫下，NaHS處理的水稻種子萌發效果較佳，這是由于干旱脅迫下，H2S可通過提高水稻種子抗氧化酶活性，解除對可溶性蛋白合成的抑制，進而抑制質膜透性增加，提高水稻種子的抗旱性；單長卷等[16]研究表明，外源一定濃度H2S能夠影響玉米葉片及根系的水分特征，提高玉米葉片及根系的相對含水量，增強玉米幼苗的抗旱性。山東省果樹研究所板栗育種與栽培課題組前期研究結果表明，15% PEG脅迫下添加0.5 mmol·L-1NaHS處理有效降低了干旱脅迫下板栗幼苗細胞膜受損程度，提高了板栗的抗旱性[5]。本研究以H2S供體NaHS及H2S清除劑次牛磺酸(hypotaurine, HT)處理黃棚板栗當年生實生幼苗，進一步探討H2S對干旱脅迫下板栗幼苗根系抗氧化特性及呼吸相關酶活性的影響，以期闡明其調控植物抗旱性的生理生化機制，為進一步探究H2S緩解板栗樹干旱脅迫的機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試材料：黃棚板栗，由山東省果樹研究所萬吉山試驗基地提供。

試驗于2016年在山東農業大學園藝試驗站進行。選取飽滿且均勻一致的種子，5月20日播種于陶盆(高28 cm、直徑25 cm)內，盆內裝有酸洗潔凈的石英砂，基質為草炭∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1。播后澆灌Hoagland營養液培養，至7月中旬待植株長至3～4片真葉時，選取生長一致的植株進行處理。試驗設置7個處理：1)對照(CK)：Hoagland營養液；2)NaHS：Hoagland營養液+0.5 mmol·L-1NaHS；3)PEG：Hoagland營養液+15% PEG；4)NaHS+PEG：Hoagland營養液+15% PEG+0.5 mmol·L-1NaHS；5)PEG+HT：Hoagland營養液+15% PEG+ 0.3 mmol·L-1HT；6)NaHS+PEG+HT：Hoagland營養液+15% PEG+0.5 mmol·L-1NaHS+ 0.3 mmol·L-1HT；7)HT：Hoagland營養液+0.3 mmol·L-1HT。每處理重復3次，每個處理100 mL。處理后24 h分別取樣，液氮速凍后-80℃保存，用于生理指標的測定。

1.2 測定指標及方法

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法測定；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創木酚法測定；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用紫外吸收法測定；過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)含量采用硫酸鈦沉淀法[17]測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法[18]測定；脯氨酸(proline, pro)含量采用磺基水楊酸提取茚三酮顯色法[19]測定；蘋果酸脫氫酶(malic dehydrogenase, MDH)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G-6-PDH)活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

1.3 數據處理

采用DPS v7.05進行數據分析；Microsoft Excel 2003作圖。結果均為3次重復試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗根系抗氧化物酶活性的影響

正常生長環境中，植物體內ROS的產生與清除處于動態平衡狀態；但在逆境脅迫下，細胞內生成大量的ROS，導致細胞處于氧化脅迫狀態，引發脂質過氧化、蛋白質降解、核酸損傷和酶失活，甚至導致細胞死亡，從而抑制植物生長[20]。干旱脅迫下，植物體通過各種抗氧化劑及激活相關酶等應激反應來降低氧化毒性和維持ROS的動態平衡[21]。由圖1可知，正常生長條件下，與CK相比，外源單獨NaHS處理均上調了板栗根系SOD、POD、CAT、APX活性，其中CAT活性顯著高于CK，單獨HT處理下，POD、APX活性顯著上調，SOD、CAT活性略高于CK，但差異不顯著。而15% PEG模擬干旱脅迫處理后，板栗根系SOD、POD、CAT、APX活性均顯著升高，分別較CK高70.04%、115.3%、164.9%、27.56%；與單獨PEG脅迫處理相比，外源NaHS處理后，SOD、POD、CAT、APX活性分別提高19.64%、24.67%、56.91%、16.29%，且差異顯著；PEG+HT處理下，APX活性顯著低于單獨PEG處理，SOD、CAT活性較PEG略有浮動，但差異不顯著；PEG+NaHS+HT處理下的CAT活性顯著上調，其他3種酶活性與單獨PEG處理間均無顯著差異。結果表明，外源NaHS處理可以通過提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性來增強干旱脅迫下細胞對ROS的清除能力，而添加H2S清除劑HT可以逆轉上述效果。

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as following.圖1 干旱脅迫下外源H2S對板栗幼苗根系SOD、POD、CAT、APX活性的影響Fig.1 Effect of exogenous H2S on the SOD,POD,CAT,APX activity in root of chestnut seedlings under drought stress

2.2 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗根系MDA、H2O2含量的影響

植物遭受脅迫環境時，膜質過氧化產物之一的MDA大量生成[22]。MDA是反映膜系統受損程度和植物抗逆性的重要指標。由圖2、圖3可知，在正常生長條件下，與CK相比，單獨NaHS處理板栗根系MDA含量略有提高，H2O2含量則顯著降低；單獨HT處理下根系MDA、H2O2含量均高于CK，但差異不顯著。而單獨PEG脅迫處理下MDA、H2O2含量顯著升高，分別較CK高85.84%、31.79%。與單獨PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著降低了板栗根系MDA、H2O2含量，分別降低26.52%、20.86%；PEG+NaHS+HT處理下MDA含量顯著低于單獨PEG處理，降低了19.46%，H2O2含量略有下降，但差異不顯著；與單獨PEG處理相比，PEG+HT處理的根系MDA含量略有下降，而其H2O2含量則顯著下降。結果表明，外源H2S處理可以明顯緩解由于干旱造成的ROS過量積累，并降低細胞膜質過氧化水平，緩解過氧化傷害，而添加HT處理則抑制了NaHS的效果，無法有效緩解細胞膜脂過氧化傷害。

圖2 干旱脅迫下外源H2S對板栗幼苗根系MDA含量的影響Fig.2 Effect of exogenous H2S on MDA content in root of chestnut seedlings under drought stress

圖3 干旱脅迫下外源H2S對板栗幼苗根系H2O2含量的影響Fig.3 Effect of exogenous H2S on the H2O2 content in root of chestnut seedlings under drought stress

2.3 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗根系脯氨酸含量的影響

脯氨酸是逆境條件下植物體內氮和能量的貯存庫，對降低細胞內溶質的滲透勢、維持細胞內酶正常結構和構象具有重要意義。在干旱脅迫下，植物體內積累大量脯氨酸，可以起到滲透調節的作用，防止細胞脫水[5]。由圖4可知，正常生長條件下，與CK相比，單獨NaHS處理與HT處理的板栗根系脯氨酸含量分別提高7.7%、5.3%，但差異不顯著。單獨PEG脅迫處理下脯氨酸含量顯著升高，較CK增加了51.34%；與單獨PEG處理相比，PEG+NaHS處理下板栗根系脯氨酸含量顯著增加15.25%，PEG+NaHS+HT和PEG+HT處理均與單獨PEG處理間的脯氨酸含量無顯著差異。結果表明，外源H2S處理顯著提高了干旱脅迫下板栗根系脯氨酸含量，而添加清除劑HT處理對脯氨酸含量變化無明顯效果。

圖4 干旱脅迫下外源H2S對板栗幼苗根系脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of exogenous H2S on the proline content in root of chestnut seedlings under drought stress

2.4 干旱脅迫下H2S對板栗根系MDH、PFK和G-6-PDH活性的影響

呼吸作用作為植物體內主要的物質和能量代謝途徑，是一切生命活動的中心，同時呼吸作用的中間產物為植物體其他組織器官的形成提供重要的碳骨架[23]。MDH、PFK和G-6-PDH是調節各途徑呼吸速率的關鍵酶，其活性的高低直接影響呼吸速率的強弱。由圖5可知，正常生長條件下，與CK相比，單獨NaHS處理下MDH、PFK和G-6-PDH活性均略有提高，但不顯著，單獨HT處理對這3種酶活性無顯著影響。而單獨PEG脅迫處理下MDH、PFK和G-6-PDH活性均顯著下降，分別較CK低33.08%、39.43%、29.10%；添加NaHS處理較單獨PEG處理提高了板栗根系這3種酶活性，分別高27.28%、23.14%和15.36%，而PEG+NaHS+HT、PEG+HT處理下，除MDH活性顯著高于單獨PEG脅迫處理外，其他2種酶活性均無顯著變化。結果表明，外源H2S處理顯著提高了干旱脅迫下MDH、PFK和G-6-PDH活性，從而緩解了干旱脅迫對板栗幼苗根系呼吸代謝的影響，提升了板栗幼苗應對干旱脅迫的能力，而添加抑制劑HT對酶活性變化無顯著影響。

圖5 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗根系MDH、PFK和G-6-PDH活性的影響Fig.5 Effect of exogenous H2S on the MDH,PFK,and G-6-PDH activity in root of chestnut seedlings under drought stress

3 討論

3.1 H2S對干旱脅迫下板栗實生幼苗抗氧化特性的影響

MDA是膜脂過氧化產物之一，H2O2是植物有氧代謝的副產物，可調節植物對環境的適應能力，二者含量是反映膜系統受損程度和植物抗逆性的重要指標。Zhang等[34]研究表明，H2S可有效減少大豆干旱脅迫下H2O2的累積；劉晶[15]等研究發現干旱脅迫下水稻種子的MDA含量不斷增加，而PEG+NaHS處理下MDA含量顯著低于PEG。本研究中，干旱脅迫導致板栗幼苗根系MDA、H2O2含量均顯著升高，而添加NaHS處理顯著降低了根系中MDA、H2O2含量，表明添加外源NaHS可顯著降低由旱脅迫導致的膜脂過氧化水平，有效穩定膜結構，從而增強板栗幼苗對干旱脅迫的抗性，而添加HT處理抑制了外源H2S緩解板栗幼苗根系MDA、H2O2含量升高的作用，無法有效緩解細胞膜脂過氧化傷害。

游離脯氨酸作為植物細胞內重要的滲透調節物質，對植株的代謝及生長發育有重要作用。逆境脅迫下，細胞能主動積累脯氨酸，來調節細胞滲透勢，保護植物組織內各種酶類和細胞膜結構的正常功能[35]。與對照相比，干旱導致板栗幼苗根、葉的脯氨酸含量顯著增加。與單獨PEG脅迫處理相比，外源NaHS處理可以顯著增加干旱下板栗幼苗根系的脯氨酸含量，這與李永生[33]的研究結果一致。添加外源NaHS增大了細胞質濃度，降低了滲透勢，使細胞在低滲透勢條件下仍能從胞外吸水，調節細胞的滲透平衡，從而增強板栗的抗旱性；而添加清除劑HT對脯氨酸含量變化無明顯效果，與PEG處理差異不顯著，進一步說明H2S在提高板栗抗旱性方面具有重要意義。干旱脅迫下，外源H2S啟動相關生理響應機制，調節板栗幼苗根系滲透調節物質含量及抗氧化酶活性從而有效緩解旱害，而其在分子水平上如何調控干旱脅迫下板栗幼苗的生理生化反應還有待進一步研究。

3.2 H2S對干旱脅迫下板栗實生幼苗呼吸相關酶活性的影響

呼吸作用是維持植物新陳代謝和生長及進行營養物質合成與轉化最基本的力量源泉，呼吸代謝與植物的各種生理功能及形態建成如種子萌發、器官發育等密切相關[36]，其中植物根系的呼吸與植物物質代謝和能量代謝密切相關，根系呼吸進行順利與否是衡量植物根系功能和逆境脅迫的重要指標之一[37]。植物體內存在多條呼吸代謝途徑，包括糖酵解途徑(glycolysis, EMP)、三羧酸循環途徑(tricarboxylic acid cycle, TCA)、戊糖磷酸途徑(pentoso phosphate pathway, PPP)等，其中糖酵解途徑進入三羧酸循環(EMP-TCA)途徑是細胞的核心代謝途徑，提供植物生長發育物質和能量，PPP可進一步為合成代謝提供原料。研究發現干旱脅迫下，根系呼吸速率降低，呼吸代謝途徑發生改變[2]。逆境脅迫下，3種途徑交替運行，從而維持植物正常的呼吸過程，保護植物免受外界傷害并提高對環境的適應能力。其中PFK可協調淀粉和磷酸丙糖的轉化，是調控EMP的關鍵酶[37]；MDH可催化L-蘋果酸形成生化反應重要的中間產物草酰乙酸，是調控TCA的關鍵酶；G-6-PDH是調控PPP的關鍵酶，可催化PPP產生氨基酸、多糖、色素等多種中間產物，3種酶與呼吸速率密切相關，其活性高低直接影響呼吸速率的強弱[38]。本研究結果表明，干旱脅迫導致MDH、PFK和G-6-PDH活性均顯著下降，而添加NaHS處理下板栗根系3種酶活性分別較干旱脅迫高27.28%、23.14%和15.36%，在一定程度上緩解了根系的呼吸脅迫，減輕了干旱脅迫對板栗幼苗根系呼吸代謝途徑的抑制作用，提高了板栗幼苗對干旱脅迫的適應能力；而在干旱脅迫下進行NaHS預處理的同時添加HT，則逆轉了上述緩解效用，進一步說明H2S參與干旱脅迫下植物呼吸代謝調控并發揮積極作用，而關于H2S對呼吸代謝的調控是通過激活內源防御系統或通過與其他相關信號分子協作完成，還有待進一步研究。

4 結論

干旱脅迫下0.5 mmol·L-1NaHS處理顯著提高了板栗幼苗根系抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)和呼吸代謝相關酶(MDH、PFK、G-6-PDH)活性，以及根系脯氨酸含量，顯著降低了MDA、H2O2含量，減輕了干旱脅迫對植物造成的膜脂過氧化傷害及呼吸代謝的抑制，從而提高了板栗對干旱脅迫的適應能力，而添加H2S清除劑HT，則逆轉了上述緩解效果，表明H2S在提高植物抗旱性方面具有積極作用。