抗疲勞保健品中非法添加那非類物質液質篩查方法建立

郁俊杰，楊 鋮，金 凡，張靠山，吳國萍,2*

(1.江蘇警官學院 刑事技術系，江蘇 南京 210031；2.江蘇省食品藥品與環境犯罪技術檢驗工程實驗室，江蘇 南京 210031)

近年來，公安機關食藥環偵部門對保健品中非法添加化學成分的打擊一直處于高壓態勢，受到社會的廣泛關注與好評。這類非法添加案件發案率極高，屢打不盡。公安部近幾年所公布的典型案例分析，可以發現抗疲勞類保健品中基本都西地那非類藥物的檢出。2014年，浙江省食品藥品監督管理部門會同公安機關查處了貨值高達1.8億的含西地那非成分的假性藥。2017年警方查處網上銷售“清宮御酒”的店鋪，收繳該酒200余瓶，從其中檢測出違法添加的西地那非等化學物質。本文擬建立常見的那非類物質高分辨質譜的快速篩查方法，討論最佳液質檢測條件，通過保留時間及特征離子峰以及相對豐度對非法添加物進行快速篩查。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Tripe QTOF 5600+ 液質聯用儀(超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用)；電子分析天平型號ME104；

那紅地那非、偽伐地那非、那莫西地那非、紅地那非、西地那非、豪莫西地那非、愛地那非、硫代愛地那非、羥基豪莫西地那非9種標樣購于中國食品藥品檢定研究院，分別精密稱取上述標準品0.01 g于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容為1 mg/mL的儲備液，冷藏避光貯存，臨用時稀釋備用。

22種保健品來源于某市公安局食藥環偵部門繳獲，如表3所示；稱取保健品0.1 g，甲醇定容至10 mL，5000 r/min離心5 min，上清液經微孔濾膜過濾(0.22 μm，有機相)，取濾液稀釋100倍作為儲備液，供LC-MS/MS 分析。冷藏保存備用。

1.2 液質聯用儀條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×100 mm，1.8 μm)；流動相：A：5 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸緩沖溶液，B：乙腈；進樣量為5μL，梯度洗脫程序，見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質譜條件

電離方式：電噴霧正(負)離子模式。離子源參數：霧化氣壓力(GS1)50psi，輔助加熱氣(GS2)50psi，氣簾氣(CUR)35psi，干燥氣溫度：500℃，離子化電壓：正離子模式5500 V。一級質譜條件：去簇電壓(DP)：80 V，碰撞能量(CE)：10 V。二級質譜條件：碰撞能量(CE)：25～35 V；碰撞能量范圍(CES)：15～20 V。

2 結果與討論

2.1 溶劑和流動相的選取

那非類物質是非極性的有機化合物，不溶于水，易溶于有機溶劑。正離子模式下流動相的酸度對出峰時間和檢測靈敏度會產生影響。在有機相選擇乙腈作為流動相B的前提下，改變流動相A乙酸銨溶液的酸度，結果發現：不同pH值時，各待測組分的保留時間、出峰順序以及靈敏度均有所不同。經分析討論，筆者認為這與待測組分中的堿性分子結構有關。綜合比較，本次實驗選用當0.1%甲酸-5 mmol·L-1乙酸銨溶液作為流動相A，乙腈作為流動相B。在這種情況下，出現的色譜峰的呈現出峰形更尖銳，靈敏度更高等特點，滿足分析和檢測的要求。

2.2 西地那非等9種抗疲勞類藥物對照品液質篩查方法

將標準品配成100 ng·mL-1單針進樣，經過液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜解析，得到各標準品質譜圖和提取離子流圖，如圖1～9所示。分析圖1～9，得這9種那非類物質的主要質譜參數如表2所示。

圖1 那紅地那非的二級質譜圖

圖2 偽伐地那非的二級質譜圖

圖3 那莫西地那非的二級質譜圖

圖4 紅地那非的二級質譜圖

圖5 西地那非的二級質譜圖

圖6 豪莫西地那非的二級質譜圖

圖7 愛地那非的二級質譜圖

圖8 硫代愛地那非的二級質譜圖

圖9 羥基豪莫西地那非的二級質譜圖

由圖中可見，那非類各物質的分子離子峰十分明顯，但與分子離子峰相比之下，主要碎片離子峰的相對豐度顯現得不是很明顯。將西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非、紅地那非、那紅地那非、枸櫞酸艾地那非配成1 μg·mL-1混合標準液進樣，通過對結果的討論，可發現西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、硫代艾地那非、紅地那非、那紅地那非、枸櫞酸艾地那非都能夠被很好的分離出來，偽伐地那非、那莫西地那非是同分異構體，特征碎片離子也相同，不能夠進行有效地區分。

表2 那非類物質的主要質譜參數

2.3 破碎電壓對裂解程度的影響

以西地那非為例，研究破碎電壓對碎片離子相對豐度的影響。西地那非的母離子m/z為475，主要碎片離子為 m/z 377、311、283，由其結構所推出，在外界電壓的影響下，西地那非分子上的酰基 N-S 鍵首先發生斷裂，得到的碎片離子為m/z 377 。緊接著在m/z377碎片離子上發生斷裂的是C-S鍵，得到碎片離子m/z 311。再之后裂解脫去C2H4烷基自由基碎片，得到碎片離子m/z 283。認為CE=35 V時，m/z311、m/z283碎片離子峰相對于分子離子峰顯得過小，是由于破碎電壓太小，導致試劑在經過電離源時并沒有被充分電離成碎片離子。考慮到儀器的承受能力，將破碎電壓(CE值)分別調至40 V和50 V，再次進樣，得到新的質譜圖和提取離子流圖，與破碎電壓(CE值)為35 V時并列比較。通過質譜圖圖10～12，我們能清晰地看出，破碎電壓越大，西地那非分子的電離效果越好，特征碎片離子越多。考慮到Triple QTOF 5600+ 液質聯用儀的承受能力，以CE=50 V時，效果最明顯。 西地那非的裂解程度與儀器的破碎電壓有關。在本儀器的承受范圍以內，以CE值分別為35 V±20 V、40 V±20 V、50 V±20 V的時候進樣，其中CE值為50 V時，西地那非分子裂解效果最好。

2.4 市售22種抗疲勞保健品中非法添加物檢驗

圖10 CE=35 V時西地那非質譜圖與提取離子流圖

圖11 CE=40 V時西地那非質譜圖

圖12 CE=50 V時西地那非質譜圖

22種市售保健品配成1 μg·mL-1甲醇溶液，其中樣品“一想就硬”有黃色和綠色兩類藥片，將其編為兩個樣品，分別研磨溶解并編號，共計22個樣品溶液，單針進樣，同時進樣標準品，作為參照。通過綜合比較分析保健品溶液中物質的分子離子峰(m/z475)、特征碎片離子峰(m/z311、m/z283)、保留時間(8.40min)以及相對豐度，結果發現，這22個進樣溶液中，有20個溶液里檢測出西地那非。也就是說市售22種保健品里，檢測出西地那非的有20種。其質譜圖如圖10～12所示。其保留時間整理如表3所示。

表3 22種市售保健品的非法添加情況

表3(續)

3 結論

本文運用Triple QTOF 5600+ 液質聯用儀建立了同時測定西地那非、硫代艾地那非、愛地那非、偽伐地那非、那莫西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、紅地那非、那紅地那非9種常見的那非類非法添加物的液質篩查方法；并對22種保健品中進行那非類非法添加的篩查，認定有19種保健品中含有西地那非，1種含羥基豪莫西地那非。實驗簡單易行，操作方便，結論準確，便于食品保健品中非法添加違禁品案件檢測需求。