杭州市西湖景區春季空氣細菌多樣性特征

樓秀芹,郭衛俊,姚文沖,方治國,*

1 杭州市疾病預防控制中心微生物檢驗科,杭州 310021 2 浙江工商大學環境科學與工程學院,杭州 310018

生物氣溶膠是指具有生命的氣溶膠粒子(包括細菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、孢子等)以及由有生命活性的機體所釋放到空氣中各種粒子的統稱[1- 2]。空氣中的微生物是大氣生物氣溶膠的主要組成部分,其不僅具有重要的生態系統功能,影響著全球氣候變化[3- 6],還與空氣質量和人類健康密切相關。一方面,由生物粒子組成的氣溶膠,可間接作為云凝結核和冰核,導致云滴和冰晶的形成,在雨雪的形成過程中發揮著非常重要的功能,并且可通過直接散射或吸收太陽能輻射在全球氣候變化中起著至關重要的作用[5-9]；另一方面,作為空氣污染表征體系的一部分,生物氣溶膠對評價空氣污染的致病性和過敏性具有重要的作用,小部分具有活性的生物氣溶膠能夠導致各種微生物疾病發生[10]。

空氣細菌是空氣中微生物的重要組成部分,所有細菌氣溶膠都是通過自然界進入空氣中的。空氣中細菌的存在和分布是以人類為中心的[11],因此空氣細菌主要來源于自然界的土壤、動植物和人類,所有的水體界面包括湖泊、海洋、河流等也是空氣細菌的來源之一,另外一些非自然的活動如污水處理、動物飼養、發酵過程和農業活動等也是其重要來源[12- 15]。空氣中細菌的存在與人類健康有著密切的聯系,它們能夠向周圍的環境擴散,導致人類過敏反應,對免疫力低下的人們造成嚴重的健康危害[16]；容易造成人群傳染病爆發流行；污染食品,造成人們食物中毒；使醫藥品、化妝品等日常用品變質；并且能夠腐蝕用于基礎建設的金屬材料及用于科研生產的精密儀器,造成重大的經濟損失[17-19]。

杭州是浙江省省會和經濟、文化科教中心,長江三角洲中心城市之一,國家歷史文化名城和南方典型的風景旅游城市,而且杭州市被確定為2016年G20峰會的主辦城市,這更有助于顯著提升杭州市的國際地位和形象。西湖景區是杭州的地標性旅游景區,世界文化遺產,國家5A級旅游景區,中國首批國家重點風景名勝區,首批全國文明風景旅游區示范點,中國十大名勝古跡之一,中國主要的觀賞性淡水湖泊之一,在中國的歷史文化和風景名勝中占有重要地位。“杭州西湖文化景觀”于2011年正式被列入《世界遺產名錄》,成為世界文化景觀的杰出典范。作為世界聞名的旅游勝地,杭州西湖景區每年的游客接待量持續位居全國前列,來杭旅游人數不斷增加,2015年中外游客的接待量已經突破1.2億人次。2016年十一黃金周期間杭州共接待游客1578萬人次,其中西湖風景區接待游客就超過了437萬人次,顯著超出了杭州的旅游負載量。隨著杭州在國內外的知名度明顯提高,城市的人流量和車流量顯著增加,因此杭州西湖景區空氣生物性污染問題也日益突出。然而,有關杭州市西湖景區空氣微生物的研究工作至今鮮有任何報道。論文選取了杭州市西湖景區4個典型景點作為樣點,通過高通量測序研究了空氣細菌多樣性特征,可為控制西湖景區空氣生物性污染和相關管理部門制定環境政策法規提供理論指導和參考依據。

1 研究材料與方法

1.1 研究樣點概況

杭州西湖景區位于浙江省杭州市西面,景區內群山高度都不超過400米,環布在西湖的南、西、北三面,景區總面積達49 km2,其中湖面6.5 km2。景區以植物造景為主,由大量喬灌木組成疏落有致、大小不同的空間。2007年5月8日經國家旅游局正式批準為國家AAAAA級旅游景區,2011年6月24日“中國杭州西湖文化景觀”正式被列入《世界遺產名錄》。選取西湖景區具有代表性且具有不同特征的4個景點作為研究樣點,分別為柳浪聞鶯(Orioles singing in the willow-OSW)、三潭印月(Three pools mirroring the moon-TPMM)、斷橋殘雪(Melting snow at broken bridge-MSBB)和寶石流霞(Precious stone hill floating in rosy clouds-PSHFRC)。柳浪聞鶯(OSW)位于西湖東南岸,園內垂柳林立,遍及紫楠、雪松、廣玉蘭和梅花等。斷橋殘雪(MSBB)位于西湖白堤東端,是西湖景區人流量最大的景點之一。三潭印月(TPMM)是西湖中最大的島嶼,風景秀麗、景色清幽,綠樹掩映、花木扶疏,湖岸垂柳拂波。寶石流霞(PSHFRC)位于西湖北岸自成一體的葛嶺和寶石山,保俶塔巍然挺秀,景色奇特。

1.2 空氣微生物取樣器

采用法國Bertin* Coriolis μ 空氣生物采樣器進行取樣,Coriolis μ采用全新的氣旋式采樣技術,空氣流速最高可達300 L/min。Coriolis μ能夠高效收集空氣中的生物樣品,樣品的采集形式為液體樣品,樣品后續處理高度靈活,樣品可進行稀釋和濃縮,以獲得更大范圍更精確的生物樣品信息,用于包括瓊脂平板培養在內的多種檢測技術。

1.3 取樣方法

在杭州市西湖景區選定4個樣點(OSW、MSBB、TPMM、PSHFRC),于2016年5月選擇相同的天氣條件(晴),利用Coriolius μ空氣微生物液體采樣器進行取樣,取樣時空氣溫度為25℃,風向為東風,風速≤3級。利用Coriolius μ空氣微生物液體采樣器進行取樣,每個樣點3個重復。取樣高度距離地面約1.5 m處,空氣流速250 L/min,取樣時間為2 h。取樣時收集管初始取樣液為12 mL,為了保證收集管里液體量的穩定,每隔10 min往收集管里加少許收集液,取樣結束后將樣本帶回實驗室,然后進行DNA提取,收集的樣本用于空氣中細菌多樣性特征研究。

1.4 液體樣品的濃縮與DNA提取方法

利用Coriolius μ空氣微生物液體采樣器收集的樣本通過高速離心和濃縮過濾管過濾后收集約100 μL的原液混合物,然后轉移至1.5 mL離心管中,將濃縮后的樣本利用QIAamp DNA Mini Kit(50)試劑盒提取空氣細菌基因組DNA,將檢測合格的細菌基因組DNA樣本送至上海祥音生物科技有限公司進行搞通量測序。

1.5 空氣細菌高通量測序

以樣品DNA作為PCR反應模板,擴增16S rRNA基因的V3—V4區。PCR反應正反向引物分別為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′,擴增后得到425 bp的擴增片段,檢測合格后,添加測序接頭,選用Miseq PE300平臺實施雙末端測序。

1.6 數據處理

1.6.1質量控制

Hiseq雙端測序原始序列3′端可能帶有adaptor接頭序列,以及一些少量低質量序列和雜質序列。利用cutadapt軟件(Version 1.16)去除3′端測序接頭,利用Pandaseq軟件(Version 2.9)根據雙端測序序列的重疊關系將成對的reads拼接成一條序列,得到高變區的原始序列(raw read)。對拼接后的序列進行質控分析(去除尾部質量值低于20以下堿基和含N堿基部分序列的reads)獲得有效序列(clean reads)。

1.6.2OTUs與多樣性分析

將拼接的有效序列中的singletons過濾掉,利用Uparse(Version 7.0.1001)去除嵌合體,并在97%的相似度下對序列進行聚類,得到用于物種分類的OTUs。在保證測序深度足夠的前提下,對每個樣本進行歸一化處理。然后,對抽平后的序列聚類的OTUs進行微生物分析和主成分(PCA)分析。

1.6.3群落結構組成和相似性分析

從OTUs中挑選出豐富度最高的一條序列作為代表序列,與16S rDNA數據庫(Greengenes)在97%的相似性下進行比對,從而對OTUs進行物種注釋,并根據每個OUT中序列的條數得到OUT分布表,對物種豐度和熱圖進行分析。利用QIIME軟件(Version 1.9.0)計算Alpha多樣性和Beta多樣性指數。

2 研究結果

2.1 空氣細菌OUT及α多樣性分析

采集的空氣細菌樣品,經DNA提取、檢測和高通量測序后,將所得原始數據進行拼接、質控和去除嵌合體,共得到252325條序列。通過分析總共獲得OTU數量為17795,其中OSW的OTU數量為3771,TPMM為4261,MSBB為5075,PSHFRC為4688。從OTU研究結果中可知,西湖景區不同樣點空氣細菌群落豐富度差異顯著,OSW空氣中細菌豐度最小,而MSBB空氣中細菌豐度較大。

表1是不同樣點α多樣性指數,MSBB的香農指數、ACE指數、Chao1指數、Coverage指數、Simpson指數分別為6.07、20673、13072、0.95、0.0123,而PSHFRC的上述指數分別為5.43、21790、12401、0.95、0.0371。與其他樣點相比,MSBB空氣中細菌豐富度較高,均勻度較低,而PSHFRC空氣中細菌豐富度較低,均勻度較高。

表1 杭州市西湖景區不同樣點空氣細菌樣品Alpha多樣性指數

MSBB：斷橋殘雪,melting snow at broken bridge；OSW：柳浪聞鶯,orioles singing in the willow；PSHFRC：寶石流霞,precious stone hill floating in rosy clouds；TPMM：三潭印月,three pools mirroring the moon

2.2 空氣細菌群落結構組成分析

各樣點細菌相對含量最多的均為變形菌門(Proteobacteria),分別是MSBB占54.54%,OSW占53.49%,PSHFRC占60.15%,TPMM占56.97%,其在4個樣點中的平均相對含量為56.29%；其次為放線菌門(Actinobacteria),分別是MSBB占19.37%、OSW占16.03%、TPMM占15.23%、PSHFRC占11.73%,其在4個樣點中的平均相對含量為15.59%。細菌門分類水平上,OSW和TPMM相對含量第三的是厚壁菌門(Firmicutes),分別占9.65%和11.6%,第四的是擬桿菌門(Bacteroidetes),分別占6.86%和5.55%；MSBB和PSHFRC與之相反,相對含量第三的是擬桿菌門,分別占7.31%和7.86%,第四是厚壁菌門,分別占7.09%和5.32%。從以上的研究結果可以得出,西湖景區各樣點空氣細菌在門水平上相對含量較多的為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,這4門細菌總的相對含量在各樣點分布特征為MSBB占88.31%,OSW占86.03%,PSHFRC占85.06%,TPMM占89.28%(圖1)。

圖1 門分類水平西湖景區不同樣點空氣細菌的相對豐度 Fig.1 Relative abundance of airborne bacteria in the level of phylum classification at different sampling sites in West Lake scenic areasMSBB斷橋殘雪：melting snow at broken bridge；OSW：柳浪聞鶯,orioles singing in the willow；PSHFRC：寶石流霞,precious stone hill floating in rosy clouds；TPMM：三潭印月,three pools mirroring the moon

杭州市西湖景區各樣點空氣中共有細菌954屬,其中MSBB的優勢菌群依次為馬賽菌屬(Massilia)(6.22%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(3.61%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium) (3.53%)、副球菌屬(Paracoccus)(3.16%)、劉志恒菌屬(Zhihengliuella)(2.6%)、薄層菌屬(Hymenobacter) (2.22%)、異常球菌屬(Deinococcus)(2.21%)；TPMM的優勢菌群依次為兩面神菌屬(Janibacter)(6.45%)、甲基桿菌屬(5.44%)、馬賽菌屬(4.99%)、芽孢桿菌屬(Bacillus) (3.36%)、鞘氨醇單胞菌屬(2.9%)、異常球菌屬(2.51%)、微紅微球菌屬(Rubellimicrobium) (2.19%)；OSW相對含量較多的菌群為鞘氨醇單胞菌屬(6.05%)、兩面神菌屬(3.91%)、異常球菌屬(3.29%)、馬賽菌屬(3.15%)、食酸菌屬(Acidovorax)(3.01%)、副球菌屬(2.98%)、甲基桿菌屬(2.54%)；PSHFRC的優勢菌群則依次為甲基桿菌屬(11.5%)、鞘氨醇單胞菌屬(11.21%)、異常球菌屬(4.74%)、薄層菌屬(3.72%)、微紅微球菌(2.83%)、食酸菌屬(2.06%)。從以上研究結果可以得出,MSBB樣點馬賽菌屬相對含量顯著高于其他菌屬,而PSHFRC樣點馬賽菌屬相對含量為0.93%；OSW樣點鞘氨醇單胞菌屬顯著高于其他菌屬,而TPMM樣點鞘氨醇單胞菌屬相對含量為2.9%；PSHFRC樣點則甲基桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬顯著高于其他菌屬,而OSW樣點甲基桿菌屬相對含量為2.54%；TPMM樣點兩面神菌屬顯著高于其他菌屬,而PSHFRC樣點兩面神菌屬相對含量為0(圖2)。因此,西湖景區各樣點不同細菌在屬水平上相對含量差異非常顯著。此外,各樣點相對含量在2%以上的細菌屬主要有鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、薄層菌屬和異常球菌屬,這些菌屬是西湖景區不同樣點共有的優勢菌群。

圖2 屬分類水平西湖景區不同樣點空氣細菌的相對豐度Fig.2 Relative abundance of airborne bacteria in the level of genus classification at different sampling sites in West Lake scenic areas

2.3 不同樣點空氣細菌群落結構相似性分析

從屬分類水平挑選豐富度最高的前40個物種作物種豐富熱圖,從圖中可以看出,西湖景區各個樣點空氣細菌群群落差異顯著(圖3),從不同樣點空氣細菌樣品主成分分析來看,能夠得到一致的結果。西湖景區空氣中優勢細菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、馬賽菌屬、異常球菌屬、薄層菌屬和兩面神菌屬。兩面神菌屬相對豐度在各樣點OSW(3.91%)、TPMM(6.45%)與MSBB(0.03%)、PSHFRC(0)差異非常顯著；芽孢桿菌屬相對豐度在各樣點TPMM(3.36%)與MSBB(0)、OSW(0.31%)、PSHFRC(0.22%)差異顯著；馬賽菌屬相對豐度在樣點TPMM(4.99%)、MSBB(6.22%)、OSW(3.15%)與PSHFRC(0.93%)差異顯著(圖4)。

圖3 屬水平西湖景區不同樣點空氣細菌樣品物種豐度熱圖Fig.3 Species abundance heatmap of airborne bacteria in the level of genus at different sampling sites in West Lake scenic area

3 討論

在杭州市西湖景區選取了4個典型樣點,系統研究了西湖景區空氣細菌群落特征。在細菌門水平上,各樣點優勢細菌門均為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,其總相對含量在MSBB、OSW、PSHFRC和TPMM分別為88.31%、86.03%、85.06%和89.28%,不同樣點空氣細菌門水平上存在一定的差異,OSW和TPMM厚壁菌門分別占9.65%和11.6%,擬桿菌門分別占6.86%和5.55%,MSBB和PSHFRC擬桿菌門分別占7.31%和7.86%,厚壁菌門分別占7.09%和5.32%。在細菌屬水平上,各樣點優勢細菌屬及含量差異顯著,MSBB、TPMM、OSW和PSHFRC含量最大的優勢菌屬分別為馬賽菌屬、兩面神菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和甲基桿菌屬,分別占6.22%、6.45%、6.05%和11.5%,各樣點相對含量均高于2%的菌屬有鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、薄層菌屬和異常球菌屬,這些菌屬是西湖景區共有的優勢菌群。姚文沖等研究了杭州市不同功能區空氣細菌群落特征,空氣中以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、藍細菌門(Cyanobacteria)和放線菌門為優勢菌群,但不同功能區及不同季節其豐度存在顯著差異,且優勢細菌屬與西湖景區顯著不同[20]；張旭等研究了浙江大學紫金港校農業生命環境大樓空氣細菌群落組成,空氣中顆粒物樣品上以變形菌門(24.63%—54.22%)、藍細菌門(6.10%—20.27%)、厚壁菌門(9.91%—29.76%)、放線菌門(9.27%—18.87%)和擬桿菌門(7.52%—24.29)為主,累計豐度約達90%。西湖景區和上述研究的樣點均在杭州,但由于樣點周邊環境顯著不同,空氣中優勢細菌門存在一定的差異,在西湖景區藍細菌門豐度較低,而在浙江大學紫金港校區藍細菌門豐度較高,而西湖景區優勢菌屬與杭州不同功能區差異顯著[21]。王丹丹等研究了塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣細菌群落多樣性,發現其空氣中細菌主要有4門37 屬,優勢菌群為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門,分別占67.6%、17.6%、11.7%和2.9%,優勢菌屬為微桿菌屬(Microbacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、柄桿菌屬(Caulobacter)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、海洋桿菌屬(Pontibacter)和根瘤菌屬(Rhizobium)。在門的水平上,西湖景區空氣細菌特征與塔克拉瑪干沙塵暴源區基本相似；在屬水平上,兩地空氣細菌群落差異顯著,其優勢菌群明顯不同,這可能是由于兩地顯著不同的環境特征而引起的[22]。凌琪等利用可培養法研究了黃山風景區空氣細菌特征,經鑒定得出優勢菌屬依次為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、微球菌屬(Micrococcus)和假單胞菌屬,分別占總細菌的37.7%、17.2%、10.1%、9.8%[23],這與本研究中空氣細菌群落結構差異顯著。一方面,由于環境中絕大多數細菌是不可培養的,而可培養的細菌只占總數的0.1%—10%,在營養貧瘠的空氣中比例可能更低[24],這就導致了利用培養法和非培養法研究空氣中細菌群落的顯著差異[25]；另一方面,黃山風景區和西湖景區兩地的環境特征不同,黃山風景區海拔較高,西湖景區具有較大的水域面積,雖然兩地的植被覆蓋率較高,但植被類型顯著不同,這些也是導致西湖景區和黃山風景區空氣中細菌種類不同的原因。

從OTU和多樣性指數分析來看,與其他樣點相比,MSBB空氣中細菌豐富度較高,均勻度較低,而PSHFRC空氣中細菌豐富度較低,均勻度較高。研究表明,人員流動、車輛活動和綠化植被是影響空氣中細菌特征的最重要因素,空氣中細菌種類和含量與地面擾動有著顯著的關系[17- 19,26]。MSBB是西湖景區游客流量最大的景點之一,一方面,人員頻繁活動容易使得地面的塵埃粒子漂浮在空氣中形成飄塵,使得周邊環境中細菌的豐度都顯著增加；另一方面,人流量較多的地方,皮膚表面所攜帶的細菌可能會釋放到空氣中,且人們也可通過噴嚏等形式把大量的細菌釋放到空氣中,使得周邊環境中病原性細菌的種類和含量明顯增加。這些因素也是引起MSBB空氣中細菌均勻度較低的重要原因。OSW是西湖景區植被覆蓋及綠化最好的景點之一,空氣濕潤,較為陰涼,綠地對空氣細菌有明顯的濾除作用,總體環境不利于空氣中細菌的生長和繁殖[27],并且不同種類植物的揮發性分泌物對空氣細菌有顯著的滅殺作用[28-30],使得OSW空氣中病原性細菌種類較少。PSHFRC是位于西湖北岸的葛嶺和寶石山上,海拔明顯高于其他樣點,且游客數量顯著低于其他景點,這就導致了其空氣細菌豐富度較低和均勻度較高。

圖4 西湖景區不同樣點空氣細菌樣品主成分分析 Fig.4 PCA analysis of airborne bacteria at different sampling sites in West Lake scenic area

4 結論

杭州市西湖景區不同景點空氣細菌多樣性特征差異顯著,各景點豐富度和均勻度明顯不同,MSBB空氣細菌豐富度較高,均勻度較低,而PSHFRC豐富度較低,均勻度較高。在細菌門水平上,各景點優勢細菌為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,但不同景點空氣細菌群落及含量存在一定的差異；在細菌屬水平上,MSBB、TPMM、OSW和PSHFRC相對含量最高的菌屬分別為馬賽菌屬、兩面神菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和甲基桿菌屬,各景點優勢菌屬及含量差異顯著。我國旅游景區空氣微生物的研究總體上比較薄弱,因此有必要加強與人類活動密切相關的旅游景區空氣微生物群落結構及多樣性特征研究。