種植時間對西藏地區青貯玉米發酵品質和微生物多樣性的影響

商振達，譚占坤，李家奎，卓 嘎，王宏輝，謝國平，劉鎖珠*

(1. 西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝860000； 2. 西藏高原飼料加工工程研究中心，西藏 林芝 860000；3. 華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢 430070)

西藏地區位于中國青藏高原西南部，畜牧業是其農業經濟的主導產業，具有不可替代的社會、經濟作用[1]。但由于西藏高海拔、高寒的惡劣自然環境，導致草地生產能力極低，牧草生長期短，優質飼料資源嚴重缺乏，難以為家畜提供充足的飼草資源，當前飼料的短缺已成為制約西藏畜牧業發展的重要問題[2]。因此，開發擴大飼料來源，是解決西藏地區家畜飼糧短缺的有效措施。

青飼玉米作為一種優質的飼料作物，具有再生能力強、生長速度快、營養價值高、適口性好等優點[3-4]，近年來在西藏拉薩、林芝、山南、昌都等地廣泛種植。青貯作為一種青飼料的貯存技術或方法，具有減少飼草養分損失，有利于動物消化吸收，增高飼草的利用價值、擴大飼料來源、調整飼草供應時期等作用。青貯是一個非常復雜的生化物質轉化和微生物活動的過程，青貯過程中飼草的營養成分和微生物菌群的變化都會對青貯飼料的發酵品質產生很多影響。因此，深入了解玉米的營養成分和青貯過程中微生物菌群結構的變化情況，可以更好的分析影響青貯玉米發酵品質的因素，進而提高玉米青貯的成功率[5-8]。

大量的研究表明，青飼料的不同種植季節和收割時間會影響其營養成分[9-10]。近年來，隨著高通量測序技術的不斷發展，該技術在微生物研究領域已被廣泛使用，高通量測序技術能夠更深入、直觀、準確地檢測到青貯飼料微生物群落的多樣性，可以測定微生物從門、綱、目、科、屬各個水平上的構成及豐度[11-14]。因此，本研究對西藏林芝地區不同種植時間玉米的營養成分和青貯玉米的發酵品質進行測定分析，并利用高通量技術檢測不同種植時間對玉米青貯后微生物菌群結構的影響，為提高西藏地區青貯玉米的發酵品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將種植于西藏林芝西藏農牧學院實習牧場試驗地完熟期的春玉米和夏玉米于2017年10月15日刈割。其中，春玉米種植時間為2017年3月20日，夏玉米種植時間為2017年6月10日。全株春玉米和全株夏玉米的化學成分見表1。

表1 青貯材料營養成分Table 1 The nutritional ingredients of silage materials

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，設置8個處理，分別為全株春玉米青貯組(分別為A1青貯7天、B1青貯14天、C1青貯30天、D1青貯60天)、全株夏玉米青貯組(分別為A2青貯7天、B2青貯14天、C2青貯30天、D2青貯60天)，每組青貯結束后打開小型實驗用青貯窖取樣進行分析，每個處理取3袋作為3個重復，共24袋。

1.3 試驗方法

1.3.1青貯飼料的制作 將全株春玉米和夏玉米均切成1～3 cm后稱取55 g，快速裝填并壓實于110 ml的小型實驗用青貯窖中密封后，置于室溫條件下保存，分別在青貯第7,14,30和60 d后打開，取樣進行分析。

1.3.2樣品預處理 青貯窖打開后，取出全部青貯飼料將其混勻，稱35 g放入100 m1的廣口三角瓶，加入105 g的去離子水(青貯飼料:水=1:3)，在4℃的冰箱內浸提24小時。然后對青貯飼料進行榨汁和過濾，將上清液用過濾漏斗通過二層沙布和濾紙過濾，保存濾液(—20℃冷凍箱保存)待測。濾液用來測定pH值、乳酸、氨態氮和揮發性脂肪酸。將剩余的部分青貯飼料收集起來烘干，稱重粉碎，測定干物質、總氮、粗蛋白以及水溶性碳水化合物含量。部分剩余的，未烘干青貯飼料裝入無菌的50 ml凍存試管中，保存于—20℃冰箱中，用于測定青貯飼料中微生物菌群的多樣性。

1.4 試驗方法

1.4.1青貯飼料發酵營養成分測定 干物質(Dry matter，DM)采用將青貯飼料放置于105℃的烘箱中烘2 h，然后將烘箱調至65℃的恒溫繼續烘60 h直至恒重的方法測定[15]；用HANNA pH211精密pH計(意大利HANNA公司)對青貯樣品處理后的過濾液直接測定pH；使用日立高效液相色譜儀測定青貯飼料中揮發性脂肪酸(Volatile fatty acids，VFAs)含量；采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]和硫酸-蒽酮比色法[17]分別測定氨態氮(Ammonia nitrogen，AN)和水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)含量；總氮(Total nitrogen)通過凱氏定氮法測定[18]。

1.4.2青貯飼料微生物多樣性的測定 將以每個青貯組中的3個重復樣品均勻的混合在一起。使用試劑盒提取青貯飼料中的微生物組總DNA，利用前引物和后引物獲得細菌16S rRNA基因V3-V4高變異區。擴增產物回收純化，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序并對結果進行分析。Illumina HiSeq測序及結果分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司協助完成。

1.5 數據處理

使用QIIME軟件，調用UCLUST這一序列比對工具[19]，對前述獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU(Operational Taxonomic Unit)[20]劃分，將OTU序列與Greengenes數據庫[21]的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應的分類學信息。通過不同生物信息學算法計算Alpha多樣性，使用QIIME軟件進行各分類水平的分類學組成分析，并用R軟件(R package)將數據繪制成柱狀圖，通過主成分分析(Principal component analysis，PCA)方法，對群落數據結構進行自然分解，從而觀測樣本之間的差異[22]。通過IBM SPSS Statistics軟件對試驗數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 西藏地區春玉米與夏玉米青貯發酵品質及營養成分變化

整個青貯過程中，春玉米青貯組中干物質含量和pH值始終顯著(P<0.05)高于夏玉米青貯組，而夏玉米青貯組中乳酸和乙酸含量始終顯著(P<0.05)高于春玉米青貯組。隨著青貯天數的逐漸增加，春玉米與夏玉米青貯組中，干物質含量都顯著下降(P<0.05)或下降(P>0.05)，青貯第7 d干物質含量最高，分別為311.63 g·kg-1和182.61 g·kg-1；pH值都有先下降后上升的趨勢，青貯第30 d時pH值最低，分別為4.15和3.77；相應的，乳酸含量都呈現先上升后下降的趨勢，青貯第30 d時乳酸含量最高，分別為37.61 g·kg-1和70.30 g·kg-1。乙酸含量都呈現先上升后下降的趨勢，春玉米青貯組在青貯第30 d時，乙酸含量最高(16.33 g·kg-1)，而夏玉米青貯組在青貯第14 d時，乙酸含量最高(34.83 g·kg-1)。整個青貯過程中，各青貯組中丁酸含量均低于10 g·kg-1，且同一青貯時間下，夏玉米組中丁酸含量均低于春玉米組(表2)。

如表3所示，春玉米青貯組中氨態氮/總氮的值均顯著高于(P<0.05)或高于(P>0.05)夏玉米青貯組，而各春玉米青貯組中水溶性碳水化物含量均顯著低于(P<0.05)或低于(P>0.05)各夏玉米青貯組。隨著青貯天數的逐漸增加，各青貯試驗組中氨態氮/總氮的值逐漸升高，在青貯第7 d時，青貯組中氨態氮/總氮的值最低，分別為45.15 g·kg-1和35.80 g·kg-1，而青貯第60 d時，青貯組中氨態氮/總氮的值最高，分別為55.36 g·kg-1和54.92 g·kg-1，但都低于100 g·kg-1，且同一青貯天數下，各夏玉米青貯組中氨態氮/總氮的值均低于春玉米青貯組；各青貯試驗組中水溶性碳水化合物含量逐漸下降，在青貯第7 d時，青貯組中水溶性碳水化合物含量最高，分別為38.73 g·kg-1和53.58 g·kg-1，而青貯第60 d時，青貯組中水溶性碳水化合物含量最低，分別為21.51 g·kg-1和25.46 g·kg-1，且同一青貯天數下，各夏玉米青貯組中水溶性碳水化合物含量均高于春玉米青貯組。

2.2 西藏地區春玉米與夏玉米青貯發酵微生物多樣性(細菌)研究

2.2.1測序結果及Alpha多樣性分析 本研究利用高通量測序技術對8個實驗組，共8份青貯飼料樣品的菌群V3-V4區進行測序，共計獲得有效序列288 470條，樣品平均有效序列為36 058條。按照97%的相似度對OTUs進行精簡，并對獲得的OTUs在門、綱、目、科、屬、種六個分類水平上進行鑒定，結果如圖1所示。

從圖2可見，物種觀察指數稀釋曲線隨著測試深度的不斷加深逐漸增加，其斜率逐漸減小，趨于平臺期，說明樣本測序量已經飽和，大多數菌群被覆蓋，足夠反映樣本中絕大部分細菌物種的信息。由各青貯試驗組的Alpha多樣性指數可知(表4)，隨著青貯天數的逐漸增加，春玉米青貯組中Chao1和ACE指數[23-24]呈現先上升后下降的趨勢，表明春玉米青貯組中微生物群落的豐富度先升高后下降，而在夏玉米青貯中，兩種指數呈現先下降后上升的趨勢，表明夏玉米青貯組中微生物群落的豐富度先下降后升高。除此之外，Simpson指數[25]和Shannon指數[26]在春玉米和夏玉米青貯組中的變化規律也不一樣。綜合分析四種Alpha多樣性指數可知，青貯原料的營養成分不同，會影響青貯過程中微生物菌群的結構的變化規律。

表2 西藏地區春玉米和夏玉米青貯過程中pH值、干物質和揮發性脂肪酸含量的變化Table 2 Changes of pH,DM and Volatile fatty acid contents of spring corn silages and summer corn silages during ensilage in Tibet

注：不同小寫字母表示相同處理不同青貯天數間差異顯著；不同大寫字母表示相同青貯天數不同處理間差異顯著(P<0.05)下同?！朗侵笜藴什?/p>

Note:Values with different lowercase letters indicate significant differences among ensiling days in the same treatment,values with different uppercase letters indicate significant difference among treatments in the same ensiling day at the 0.05 level,the same as below.± is the standard deviation.

表3 西藏地區春玉米和夏玉米青貯過程中氨態氮/總氮和水溶性碳水化合物含量的變化Table 3 Changes of AT/TN and WSC content of spring corn silages and summer corn silages during ensilage in Tibet

圖1 OTU分類地位鑒定圖Fig.1 The classification of OTUs in di□erent silage samples

圖2 各青貯組稀疏曲線圖Fig.2 Rarefaction analysis of experimental group

表4 各青貯組中菌群微生物多樣性指數Table 4 Diversity index of experimental group

2.2.2各青貯實驗組微生物群落主成分分析 基于OTUs水平的主成分分析(PCA)結果見圖3，兩點之間的距離越近，表明兩個樣本之間的微生物群落結構相似度越高。由圖可知，8個青貯試驗組的8個樣品能夠較明顯的區分開，說明不同青貯組中微生物群落的組成差異較明顯。其中春玉米青貯組中，隨著青貯天數的逐漸增加，各組中微生物菌群組成的差異逐漸增大。夏玉米青貯組中，青貯第7 d和第14 d時，微生物菌群組成幾乎相同，而青貯14 d后，隨著青貯天數的逐漸增加，各組中微生物菌群組成的差異逐漸增大。同一青貯天數時，夏玉米與春玉米青貯組中微生物菌群組成也存在一定的差異。

圖3 PCA分析的樣本三維排序圖Fig.3 3D Sorting Chart of PCA Analysis

2.2.3基于門水平的微生物群落結構分析 圖4顯示了在門水平上春玉米和夏玉米不同青貯天數試驗組中微生物菌群結構的變化(豐度>1%)，8個樣品中共鑒定出21個門，其中豐度大于1%的門有5個，分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，其豐度值依次為50.7%，38.5%，6.1%，2.1%和2.0%，占菌群分類的99.4%以上，0.6%左右的為其他菌門。

比較不同青貯試驗組樣品可知，青貯前30 d時，春玉米青貯組中變形菌門的豐度均高于夏玉米青貯組，而青貯60 d時，略低于夏玉米青貯組；青貯前30 d時，春玉米青貯組中厚壁菌門的豐度均低于夏玉米青貯組，而青貯60 d時，高于夏玉米青貯組；青貯第7和14 d時，春玉米青貯組中藍細菌門的豐度高于夏玉米青貯組，而青貯第30和60 d時，低于夏玉米青貯組；整個青貯過程中，春玉米青貯組中擬桿菌門的豐度均低于夏玉米青貯組；春玉米青貯組中放線菌門的豐度只要在青貯第60 d時低于夏玉米青貯組，其他青貯天數時均高于夏玉米青貯組。

圖4 基于門水平上各青貯組中微生物豐度柱狀圖Fig.4 The histograms of abundances of microbes at phylum level in each silage group

2.2.4基于屬水平的微生物群落結構分析 圖5顯示了在屬水平上不同青貯組中微生物菌群結構的變化(豐度>1%)，8個樣品中共鑒定出402個屬。如圖所示，豐度大于1%的屬有11個，總豐度占到78.1%，分別為假單細胞菌屬(Pseudomonas)，豐度為29.5%，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，豐度為24.2%，兩種菌屬為優勢菌屬；隨后依次為貪銅菌屬(Cupriavidus)，豐度為4.0%；魏斯氏菌屬(Weissella)，豐度為3.8%；明串珠菌屬(Leuconostoc)，豐度為3.3%；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，豐度為3.3%；乳球菌屬(Lactococcus)，豐度為3.2%；泛菌屬(Pantoea)，豐度為2.4%；沙雷菌屬(Serratia)，豐度為2.1%；真桿菌屬(Eubacterium)，豐度為1.1%；志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)，豐度為1.1%。其他的菌屬雖然豐度較低，但也存在一定的數量。

比較不同青貯試驗組樣品可知，隨著青貯的進行，假單細胞菌屬在春玉米和夏玉米青貯組中豐度都先升高后下降。春玉米青貯組中乳桿菌屬的豐度隨青貯天數增加而升高，在夏玉米青貯組中乳酸桿菌屬在青貯30 d后，豐度明顯下降，且除青貯第60 d外，夏玉米青貯組中乳酸桿菌屬豐度都要高春玉米青貯組。除此之外，在春玉米和夏玉米青貯組中均檢測到了其他LAB菌種，如魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬，但春玉米青貯組中三種LAB菌種的豐度都要高于夏玉米青貯組；春玉米青貯組中鞘氨醇單胞菌屬、泛菌屬、沙雷菌屬的豐度均高于夏玉米青貯組；各青貯組中均未檢測出革蘭氏陽性芽孢桿菌屬和梭菌屬。

圖5 基于屬水平上各青貯組中微生物豐度柱狀圖Fig.5 The histograms of abundances of microbes at genus level in each silage groups

3 討論

本試驗結果顯示，春玉米與夏玉米由于種植時間不同，導致其營養成分有明顯差異，春玉米中干物質和粗纖維含量高于夏玉米，而夏玉米中水溶性碳水化合物和粗蛋白含量高于春玉米，這與Neylon[27]、Weiss[28]和Johnson[29]對飼用玉米的研究結果相似。從春玉米和夏玉米青貯過程中營養成分變化可見，春玉米青貯組中干物質含量、pH值和氨態氮/總氮的值始終高于夏玉米青貯組，相應的乳酸含量始終低于夏玉米青貯組，這與夏玉米中水溶性碳水化合物含量高，而較高的水溶性碳水化合物，可以為乳酸菌提供更多的發酵底物有效的降低青貯飼料的pH值和氨態氮含量，提高乳酸產量有關[30-32]。隨著青貯天數的逐漸增加，春玉米和夏玉米青貯中干物質含量逐漸降低，pH值先下降后上升，相應的乳酸含量先上升后下降，青貯30 d時，pH最低而乳酸含量最高，青貯條件最佳。整個青貯過程中，春玉米青貯組中除青貯30 d外，pH值都沒有降至常規成功青貯要求的pH值，而夏玉米青貯組中pH值均降至常規成功青貯要求的pH值[33](4.2以下)，說明夏玉米青貯的條件要優于春玉米青貯。

本研究中，整個青貯過程中，乳酸含量的變化規律和乙酸含量的變化規律一致。表明在整個青貯過程中異性乳酸發酵占主導地位。丁酸和氨態氮/總氮是衡量青貯飼料優劣的重要標準，優質青貯飼料中丁酸含量和氨態氮/總氮值應低于10 g·kg-1DM和100 g·kg-1TN[34]，本試驗中，雖然各組丁酸含量和氨態氮/總氮均低于這一標準，但夏玉米青貯組中丁酸含量和氨態氮/總氮的值均低于春玉米青貯組。隨著青貯天數的增加，各青貯組中的氨態氮/總氮值逐漸升高。表明青貯后期較多的蛋白質可能被好氧性微生物降解為氨態氮。

青飼玉米青貯發酵過程中微生物菌群的豐度和結構的變化影響著青貯飼料的發酵品質和營養成分[35-36]。因此本研究基于高通量測序技術對玉米青貯飼料的微生物菌群進行檢測，由實驗結果得到，樣本測序量已經飽和，大多數菌群被覆蓋，足夠反映樣本中絕大部分細菌物種的信息。由四種Alpha多樣性指數可知，青貯原料的營養成分不同，會影響青貯過程中微生物菌群的結構的變化規律。且隨著青貯天數的逐漸增加，各組中微生物菌群組成的差異逐漸增大。本研究檢測到的菌群共分21個門，優勢菌門依次為變形菌門、厚壁菌門、藍細菌門、放線菌門、擬桿菌門，共分402個屬，優勢菌屬為假單細胞菌屬和乳酸桿菌屬。本研究中，夏玉米青貯組中厚壁菌門和擬桿菌門豐度高于春玉米青貯組，且春玉米青貯組中的變形菌門高于夏玉米青貯組，說明夏玉米青貯組對粗纖維的降解效果[37]和碳水化合物的利用效果[38]均好于春玉米青貯，且其抑制變形菌門的效果較好。

本研究中，假單細胞菌屬的豐度在春玉米和夏玉米青貯過程中的變化規律不同，其原因有待進一步研究。在春玉米青貯中乳桿菌屬的豐度始終低于假單細胞菌屬，說明在春玉米中，乳桿菌屬作為一種產乳酸菌，其抑制好氧性的假單細胞菌的效果較差。而在夏玉米青貯中，除青貯60 d外，其他青貯組中乳桿菌屬的豐度均高于假單細胞菌屬，說明夏玉米中，乳桿菌屬抑制好氧性細菌的效果較好[39]。在本研究中，除乳酸桿菌外，還存在其他豐度較低的LAB菌種，如魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬，且夏玉米青貯組中各種LAB菌種(乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬)的豐度和要高于春玉米青貯組；各青貯組中均未檢測到青貯飼料的重要腐敗菌(革蘭氏陽性芽孢桿菌屬和梭菌屬)。除此之外，鞘氨醇單胞菌屬、泛菌屬、沙雷菌屬等菌屬也存在于青貯玉米中，玉米營養成分不同也會使其豐度出現變化，這幾種菌屬的功能還有待進一步研究。

4 結論

不同種植時間會影響西藏地區玉米的營養成分，而不同的營養成分會導致青貯玉米發酵品質不同以及微生物菌群結構的變化規律不同。相比春玉米青貯，夏玉米青貯后降低了青貯飼料的pH值，提高了乳酸含量，降低了丁酸含量和氨態氮/總氮的值。除此之外，夏玉米青貯后還提高了厚壁菌門和擬桿菌門的豐度，降低了變形菌門的豐度；提高了LAB菌種的豐度，有效的抑制了腐敗菌的生長。因此，夏玉米的青貯效果優于春玉米。