7種植物枯萎病病原真菌的鑒定

鄭瑞瑞，安 麗，何曉婷，郝曉娟，曹 揮

（山西農業大學農學院，山西 太谷 030801）

植物枯萎病是世界范圍內重要的病害威脅之一，主要危害番茄、西瓜、甜瓜等生產。隨著瓜果蔬菜保護地的發展以及現代生活對瓜果蔬菜的需求量日益增大，單一品種的長時間種植使枯萎病菌及毒素在土壤內大量積累[1]。枯萎病菌是由鐮刀菌引起的土傳病害，發病迅速且突然，可危害茄科、蘭科、十字花科、葫蘆科、芭蕉科等多種作物，引起植物減產、植物萎蔫，在濕潤的條件下導致萎蔫、腐爛，一旦發生難以根除，成為制約植物生產的重要影響因素之一[2-4]。

鐮刀菌是一種重要的真菌類群，其中包含尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）、三線鐮刀菌[5]（Fusarium tricinctum）、燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[6]等。鐮刀菌的序列活性大，侵入植物及對植物有害的信號多樣，使植物的免疫系統難以識別，可以在多個地區、不同植物寄主上發病，使枯萎病的防治愈加困難[7]。鐮刀菌屬是真菌中最重要的植物病原物和產毒真菌，所產生的毒素是一種蛋白質、脂多糖（HPLP）的復合物[8]。如鐮刀菌酸、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），可堵塞植物導管或者使植物的細胞組織壞死[9]，在人工菌落培養基上的主要表現是菌落顏色為紅、黃、紫等色素[10]。

枯萎病病原菌屬無性孢子類鐮孢菌屬（Fusari－um oxysporum Schl.）[11]。枯萎病病原菌的菌絲體和分生孢子梗繁茂，鐮刀菌會產生3 種孢子——小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子。小型分生孢子為卵圓形至橢圓形，無色，單孢或雙孢，單生或串生，一般無隔；大型分生孢子為橢圓形至鐮刀形，無色，有3～5 個隔，兩端略彎；厚垣孢子是從分生孢子或者老的菌絲體上產生，也會產生擬菌核[12-13]。

尖孢鐮刀菌接在PDA 培養基上生長的生物學特征是菌落正面菌絲均為白色，菌絲短絨狀，繁殖4～5 代后菌落的顏色變淡，菌絲氣生狀。菌落背面顏色有白色、淺紫等[14]。

真菌的鑒定主要是形態學鑒定和分子鑒定。形態學鑒定依據真菌菌落顏色、菌絲生長狀況、孢子形態、產孢結構及有無橫隔的特征進行顯微形態分類鑒定[15]。分子鑒定是通過真菌DNA 的一些特異性序列，如核糖體保守序列、致病蛋白及相應真菌的特異性序列等遺傳物質來分析每個物種之間內在的遺傳變異，鑒定同屬、種之間的細小差異，從而對物種的種屬進行鑒定[16]。現在鐮刀菌常用的分子鑒定的手段有EF-1α 引物[7]、核糖體DNA、線粒體小亞基核糖體、β-微管蛋白及翻譯延伸因子等[5]。rDNA 的序列分析廣泛應用于真菌各個等級水平的系統學研究，其主要是利用基因間隔序列（Internal transcribed spacer，ITS）[8]引物引出核糖體基因的一段保守序列，多數真菌均可利用這一引物，在一定程度上也減少不同引物的差異性[17]。

本研究主要針對3 個地區、6 種植物上分離得到的鐮刀菌進行形態學觀察，并結合分子學鑒定明確其屬、種，為枯萎真菌病害的鑒定提供理論依據，為今后抑菌試驗和抑菌機制的研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器試劑

1.1.1 試驗材料及試劑 7 種植物枯萎病原菌包括辣椒枯萎菌（2016年7月，山西農業大學農作站）；番茄枯萎菌 1（2018年5月，山西太谷）；番茄枯萎菌2（2016年7月，重慶郊區）；蘭花枯萎菌（2016年9月，河南靈寶）；甜瓜枯萎菌（2018年5月，山西太谷）；茄子枯萎菌（2016月7月，山西農業大學農作站）；西瓜枯萎菌（2016年7月，重慶郊區）。馬鈴薯（PDA，PD）培養基；真菌DNA 快速抽提試劑盒，2×Easy Taq 酶 Mix，Marker（上海生物工程）；瓊脂、葡萄糖、無水乙醇（分析純）等。

1.1.2 主要儀器 壓力蒸汽滅菌（G154DWS）、潔凈工作臺（SW-CJ-2FD），超純水機（HF Super PWUV），高速臺式冷凍離心機（Sorvall ST 16R Centrifuge），BIO-RAD 凝膠成像儀（GelDocXR）。

1.2 試驗方法

2018年10月在山西農業大學植物病理實驗室進行試驗。

1.2.1 真菌的分離與純化 參照文獻[18]進行枯萎病病原真菌的分離與純化。

1.2.2 真菌的種屬鑒定

1.2.2.1 病原菌的形態學鑒定 利用固體培養基玻片法，依據真菌菌落顏色、菌絲生長狀況、孢子形態、產孢結構及有無橫隔的特征進行顯微形態分類鑒定[19]。

1.2.2.2 分子學鑒定 本試驗利用rDNA-ITS 引物ITS1—TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4—TCCT CCGCTTATTGATATGC，進行 PCR 擴增，退火溫度為55 ℃，30 個循環，每個循環下降0.5 ℃。1%瓊脂糖凝膠電泳110 V，25 min 進行檢測，紫外凝膠成像系統觀察并拍照，驗證DNA 提取及PCR 擴增結果。

2 結果與分析

2.1 不同枯萎病害病原真菌的形態學鑒定

在真菌的識別中，有形態學的識別，諸如菌落的形態、顏色以及在培養基的生長狀態，還有孢子的形態，菌絲的形態以及其在培養基上的生長狀態，厚垣孢子的形態及大小等。不同植株枯萎菌落形態以及孢子的生長狀態如圖1所示。

辣椒枯萎菌：菌落背面邊緣白色，中間為暗紅色，呈放射狀生長。菌落正面菌絲致密、白色，絨毛狀，邊緣為規則放射狀，菌落中央下陷。菌絲頂端分叉，生長圓滑，菌絲頂端膨大成分生孢子。大型分生孢子長橢圓短棒狀，小型分生孢子短棒狀。

番茄枯萎菌1：菌落背面橙黃色，中央顏色較深，呈中央放射狀生長，邊緣呈包圍形。菌落正面菌絲白色，呈絨毛狀。菌絲密集程度不一。菌絲頂端膨大脫落形成分生孢子，生長期為橢圓形。大型分生孢子長紡錘形，厚垣孢子產生于分生孢子中，一個分生孢子中有2 個小橢圓狀孢子。菌絲多頂端分叉增生，頂端平整或彎鉤狀，菌絲有隔。

番茄枯萎菌2：菌落背面中央的顏色較深，為紫紅色，菌落顏色整體為白色，整體中央放射狀生長。菌落邊緣卷曲狀生長。菌落正面菌絲白色，較密集，蛛網狀生長。大型分生孢子鐮刀型，有隔（0～3 個），小型分生孢子短棒狀。

蘭花枯萎菌：菌落背面淡黃色，邊緣白色，放射狀生長。菌落正面緊密、絨毛狀，菌絲白色。菌落形狀多不規則，在培養5 代后逐漸規則。菌絲上部分枝為樹叉狀，分叉短小，頂端膨大圓潤或彎鉤狀。大型分生孢子短棒狀，但兩端略尖，小型分生孢子橢圓短棒狀。

甜瓜枯萎菌：菌落背面淡黃色，菌絲密集、邊緣纖細，菌絲粗大，向上凸起生長，毛氈狀。菌絲頂端膨大圓滑，分叉短小。菌絲頂端分裂出分生孢子，菌絲有隔。大型分生孢子橢圓形短棒狀，小型分生孢子橢圓形短棒狀。

茄子枯萎菌：菌落背面深橘黃色，次之橘黃色，外緣淺橘色，呈放射狀生長，邊緣白色、發散式。菌絲稀疏網格狀，邊緣絮狀。菌絲有隔，分叉多短小，頂端尖細，頂端膨大脫落形成分生孢子，短棒狀。大型分生孢子紡錘形，由菌絲的中間細胞分裂產生。小型分生孢子卵圓形或者小紡錘形。

西瓜枯萎菌：菌落背面顏色暗紅色，邊緣有暈圈，中部出現深色的枝狀條紋。菌落正面菌絲致密，呈毛氈狀，邊緣稀疏，呈放射狀。菌絲頂端分叉，彎鉤狀。厚垣孢子卵圓形。

依據上述的孢子形態以及菌落顏色，確定采集的3 個地區、6 種植物的枯萎病病原菌的均為鐮孢屬真菌[6]。

2.2 病原真菌的分子學鑒定

利用18S 和28S rDNA 的上下游引物序列，得到7 種不同寄主的枯萎病病原菌菌株的序列結果（表1），并與NCBI Blast 上的已知序列進行比對，確定病原真菌種或亞種。

表1 不同植株枯萎病病原菌ITS 引物鑒定結果

由表1可知，利用rDNA-ITS 鑒定7 種植物枯萎病菌種的種屬，結果表明，辣椒枯萎菌、蘭花枯萎菌、番茄枯萎菌1 為鐮孢屬鐮刀菌（Fusarium redolens）；番茄枯萎菌2、甜瓜枯萎菌、西瓜枯萎菌為鐮孢屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；茄子枯萎菌為鐮孢屬擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）。

3 結論與討論

本研究從3 個地區、6 種植物枯萎植株進行分離純化枯萎病原菌，通過形態學觀察菌落顏色、分生孢子形狀、菌絲生長情況，表明分離純化的病原菌均為鐮孢屬真菌。rDNA-ITS 鑒定分離菌種的種屬結果表明，辣椒枯萎菌、蘭花枯萎菌、番茄枯萎菌1 為鐮孢屬鐮刀菌（Fusarium redolens）；番茄枯萎菌2、甜瓜枯萎菌、西瓜枯萎菌為鐮孢屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；茄子枯萎菌為鐮孢屬擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）。

本試驗形態學觀察結果和分子學鑒定分離純化的病原菌的屬結果相同，均屬鐮孢屬真菌。在形態學鑒定中，病原菌可產生不同顏色的毒素，但是孢子的差異不能鑒定病原菌的種或專化型。利用分子學鑒定可以鑒定至種或者專化型，鑒定出尖孢鐮刀菌及擬輪枝鐮刀菌。試驗結果表明，鐮孢屬菌株具有多樣性，包括鐮孢屬菌、尖孢鐮刀菌、擬輪枝鐮刀菌等。枯萎病病原菌生長地區及寄主對枯萎病菌是否為鐮孢屬沒有影響。本試驗為之后進行的抑菌試驗及抑菌機制的研究提供了基礎數據。

在真菌的分離、純化及回接過程中，因真菌生長條件的改變，會出現毒素分布不均、孢子生長狀態不一或不產生、菌絲生長形態變異、厚垣孢子出現困難、分生孢子在形態學上差異小，很難區分多種菌株之間的差異，進而使直接利用形態學鑒定鐮孢菌菌種或專化型有困難。而且對菌絲、孢子的描述困難，且對形態觀察的顯微儀器和拍攝要求極高，容易對試驗結果造成錯誤的鑒定。所以，本試驗利用分子學技術rDNA-ITS 輔助鑒定親緣關系較近的真菌如種、屬和屬以上真菌。