PMA-qPCR方法檢測陜西獼猴桃潰瘍菌優勢病原菌活菌的研究

肖 妍 劉蕓宏 高貴田,2 曹 凡 馬燕萍 趙武奇 雷玉山

(1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.陜西省獼猴桃工程技術研究中心，陜西 西安 710404；3.陜西省農村科技開發中心，陜西 西安 710054)

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的細菌性病害[1]，嚴重影響獼猴桃產業的發展。目前，該病菌的檢測主要采用PCR技術，但是常規的PCR技術不能區分樣品中病原菌的生活狀態，在對活菌DNA進行擴增的同時，也會擴增自由狀態的DNA或者死菌的DNA[2]，檢測產生假陽性，無法確定Psa的生活狀態，無法對潰瘍病的發生趨勢作出科學預測，也無法對消毒、防治效果做出科學判斷。

疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種能和DNA共價交聯的熒光染料。PMA可以通過死菌損傷的細胞膜進入死菌細胞，并且光照可使PMA的光敏基團轉化為氮賓自由基，與死菌DNA發生共價交聯，從而抑制后續DNA擴增[3-6]；活菌細胞膜完整，PMA不能進入細胞內；剩下的少量游離在溶液中的PMA則可與溶液中的水分子結合形成羥胺(—NH—OH)，失去與DNA結合的活性；PMA-qPCR技術就是利用這一特性，實現了只擴增活細胞的DNA，而不擴增死細胞的DNA[4]。

近年來，PMA-qPCR技術已被廣泛應用于多種微生物活死菌的鑒別檢測[7]，但該技術用于鑒別陜西獼猴桃潰瘍菌優勢病原菌仍鮮見報道。于小龍等[8]建立的PMA-qPCR方法，能有效對包括VBNC狀態在內的青枯菌活菌進行檢測；溫書香等[9]通過優化PMA處理條件，實現了對結核桿菌活菌的快速檢測；於穎等[10]在PMA濃度30 μg/mL下，曝光5 min，可實現對金黃色葡萄球菌活菌篩選的作用。

世界Psa主要分為三大類群，中國流行的獼猴桃潰瘍病的Psa與最近在意大利、新西蘭、西班牙、法國、葡萄牙等國流行的Psa為同一類群[11]。由于其同屬的Pseudomonassyringaepv.theae和Pseudomonasavellanae與Psa的親緣關系非常近，常規的分子標記技術很難將它們區分開[12]。Gallelli等[13]根據獼猴桃潰瘍菌的hrpW基因保守區，設計P3F/P5R1引物，不僅能區分Pseudomonassyringaepv.theae和Pseudomonasavellanae，也可以準確區分出強致病力菌株(Psa-V)與弱致病力菌株，朱丹等[14]克隆了陜西獼猴桃優勢Psa的hrpW基因保守區，其序列與Psa-V同源性為99%。

因此本研究擬利用陜西獼猴桃優勢Psa的hrpW的P3F/P5R1為引物，建立PMA-qPCR檢測方法，研究PMA濃度、暗孵育時間及曝光時間等對Psa擴增的影響，并將死菌和活菌按一定的比例混合，對PMA-qPCR方法在實際檢測中的可行性進行分析。為陜西獼猴桃潰瘍病的快速檢測、準確診斷及病情預測提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)：為陜西獼猴桃潰瘍病優勢病原菌[15]，西北農林科技大學植保學院黃麗麗教授惠贈；

PMA：美國Biotium公司；

Psa質粒標準品：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒、即用PCR擴增試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

SYBR Green I試劑盒：天根生化科技有限公司；

鹵素燈：500 W，飛利浦燈具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Psa菌懸液的制備 挑取Psa單菌落于King’s B液體培養基，24 ℃、190 r/min恒溫震蕩12 h，無菌水調節菌懸液濃度為1×107CFU/mL。

1.2.2 Psa菌膜損傷時間的確定 吸取500 μL菌懸液于1.5 mL的離心管中，沸水浴(98.3 ℃)分別處理10，11，12，13，14，15 min后立即在冰上冷卻至室溫，對照組未經沸水浴處理。吸取100 μL涂布于King’s B固體培養基上，24 ℃培養，3 d后統計單菌落數，無菌落生長視為全部是死菌，該時間為膜損傷菌的處理時間。

1.2.3 DNA提取 吸取500 μL菌液，8 000 r/min離心2 min 棄上清，按照DNA Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取DNA。

1.2.4 qPCR檢測 qPCR引物根據Gallelli等[13]，修改如下，引物序列為：GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG和CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGA-C，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應總體系為10 μL，DNA模板1.0 μL，SYBR PCR premix 5.0 μL，引物P3F、P5R1各0.6 μL，ddH2O補足至反應總體積。反應程序為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，72 ℃退火20 s，30個循環，72 ℃延伸20 s。

1.2.5 PMA處理的條件

(1)PMA工作液的制備：1 mg PMA于8 000 r/min離心2 min，加入20%二甲基亞砜(DMSO)溶液200 μL充分溶解，得到5 μg/μL PMA儲備液，于-20 ℃避光保存。

(2)抑制死菌擴增的PMA最小濃度：分別吸取6份膜損傷的死菌懸液500 μL于1.5 mL離心管，加入PMA，使PMA的終濃度分別為0，90，95，100，105，110 μg/mL，顛倒混勻，暗孵育8 min，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm的500 W鹵素燈下，曝光處理20 min，提取樣品DNA，用qPCR檢測，從而確定能夠完全抑制死菌擴增的PMA最小濃度。

(3)不影響活菌擴增的PMA最大濃度：吸取4份活菌懸液500 μL于1.5 mL離心管中，加入PMA，使PMA的終濃度分別為0，105，110，120 μg/mL，顛倒混勻，暗孵育8 min，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm 的500 W鹵素燈下，曝光處理20 min，提取樣品DNA，用qPCR分別檢測，研究不抑制活菌擴增的PMA最大濃度。

(4)暗孵育時間的優化：分別吸取5份膜損傷的死菌懸液500 μL于1.5 mL離心管，加入確定的最佳PMA工作液濃度，分別暗孵育5，6，7，8，9，10 min，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm的500 W鹵素燈下，曝光處理20 min，未加PMA的樣品作為陽性對照，提取DNA，用qPCR檢測，研究完全抑制死菌擴增的最佳暗孵育時間。

(5)曝光時間的優化：分別吸取6份膜損傷的死菌懸液500 μL于1.5 mL離心管，用確定的最佳PMA工作液濃度和最佳暗孵育時間進行處理，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm的500 W鹵素燈下，分別曝光處理5，10，15，20，25 min，未加PMA的樣品作為陽性對照，確定能夠完全抑制死菌擴增的最佳曝光時間。

(6)PMA對不同比例活菌/死菌樣品的檢測效果：將培養至107CFU/mL的活菌和死菌按照表1進行混合，經合適條件的PMA處理提取DNA，進行PMA-qPCR反應，以未加PMA處理的樣品作為對照。

表1 不同比例的活死菌樣品Table 1 Proportion of different live and dead bacteria

1.2.6 標準曲線的建立 取已知濃度的Psa質粒標準品(由生工生物工程〔上海〕股份有限公司完成)，根據式(1)換算成基因拷貝數。

(1)

式中：

A——質粒DNA拷貝數，拷貝/μL；

C——DNA濃度，ng/μL；

M——片段大小；

NA——阿伏伽德羅常數，6.02×1023。

將Psa質粒標準品10倍梯度稀釋至101，進行熒光定量PCR反應，以拷貝數對數值和所得Ct值為橫、縱坐標建立標準曲線。

1.2.7 PMA-qPCR的靈敏度 菌液10倍梯度稀釋至101，經合適條件的PMA處理提取DNA，進行PMA-qPCR的靈敏度分析。

1.2.8 獼猴桃枝條樣品活菌檢測

(1)枝條樣品的染菌：取無菌的獼猴桃枝條，切成25 g 的小塊，碾碎后放入無菌均質杯中，加入225 mL無菌水，8 000 r/min均質2 min，制成樣品勻液。分別加入101～107CFU/mL的潰瘍菌活菌懸液，作為人工染菌的樣品。

(2)采用合適條件的PMA處理提取DNA，進行PMA-qPCR檢測，根據標準曲線得到基因拷貝數，與平板計數的結果進行比較。

1.2.9 數據分析 采用DPS 7.05對試驗數據進行顯著性差異檢驗，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 Psa膜損傷時間的確定

本試驗采用食品上較常使用的高溫滅菌方式制備死菌懸液[16]。菌懸液濃度為1×107CFU/mL，熱處理不同時間，稀釋一定濃度后涂布，24 ℃培養3 d，計數結果如表2 所示，熱處理時間越長，對活菌的滅活效率越高，當膜損傷時間為13 min時，無菌落生長，因此，以13 min的沸水浴處理作為活菌的全部致死時間。

表2 時間對菌液滅活效率的影響Table 2 Effect of heat-treatment time on sterilizing rate

2.2 PMA處理條件的確定

2.2.1 PMA濃度的優化

(1)抑制死菌擴增的PMA最小濃度：由圖1可知，隨著PMA濃度的增大，Ct值逐漸增大，PMA的濃度為100 μg/mL時，Ct值增大比較小，當PMA濃度為105 μg/mL 時，對死菌DNA擴增抑制達到最大，PMA濃度為110 μg/mL時，Ct值幾乎無變化，與PMA濃度為105 μg/mL相比，無顯著性差異(P>0.05)，因此，確定抑制死菌DNA擴增最小PMA濃度為105 μg/mL。

PMA是一種能和死菌DNA共價交聯的熒光染料，活菌的完整細胞膜可阻止PMA進入，從而達到檢測活菌效果。但是，PMA濃度過高可能對活菌的細胞產生影響，導致假陰性的檢測結果[17]。趙麗青等[18]在PMA濃度2 μg/mL下，500 W鹵素燈曝光15 min可達到檢測金黃色葡萄球菌活菌的目的。曹夢琪等[19]在PMA濃度15 μg/mL 下，650 W鹵鎢燈曝光5 min，可達到檢測青枯菌活菌的目的。於穎等[10]在PMA濃度30 μg/mL下，650 W鹵素燈曝光5 min可達到篩選金黃色葡萄球菌活菌的作用，并且試驗中的菌懸液濃度均在108CFU/mL。本研究得到的Psa的最佳PMA濃度為105 μg/mL，菌懸液濃度為107CFU/mL。細菌的細胞膜差異很大，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌的細胞壁與細胞膜薄，對PMA的通透性好[20]，PMA使用濃度應該較低，但本研究得到的Psa的最佳PMA濃度與已有文獻相差較大，可能與陜西獼猴桃優勢病原菌本身對外界環境的抵抗能力有關，其對PMA產生抵抗的詳細機理還需更深層次的探究。

圖1 PMA濃度對膜損傷菌的影響Figure 1 Effect of PMA concentration on heat-treated bacteria

(2)不影響活菌擴增的PMA最大濃度：由圖2可知，活菌DNA的Ct值隨PMA濃度的增大而增大，PMA濃度為105 μg/mL時，與未加PMA的Ct值無顯著性差異(P>0.05)，說明此濃度不會對活菌DNA的擴增產生較大影響，但是當PMA使用濃度>105 μg/mL時，與未加PMA的Ct值有顯著性差異(P<0.05)，說明PMA濃度>105 μg/mL對活菌有一定的影響，因此，選擇PMA濃度為105 μg/mL作為不影響活菌擴增的PMA最大濃度。

2.2.2 暗孵育時間的確定 由圖3可知，隨著暗孵育時間的延長，Ct值逐漸增大，暗孵育時間為7 min，Ct值增大比較小，當暗孵育時間延長至8 min，對死菌DNA擴增抑制達到最大，暗孵育時間>8 min，Ct值幾乎無變化，與暗孵育時間8 min相比，無顯著性差異(P>0.05)，8 min 的暗孵育時間可完全抑制死菌DNA擴增，因此確定最佳的暗孵育時間為8 min。

圖2 PMA濃度對活菌的影響Figure 2 Effect of PMA concentration on live bacteria

抑制膜損傷菌DNA擴增除PMA濃度外，最佳的暗孵育時間也至關重要。PMA在光照條件下，與水分子結合生成羥胺，羥胺不能和DNA分子結合，從而無法抑制死菌的DNA，因此，在樣品中加入PMA要避光處理合適的時間，而暗孵育時間的長短受樣品菌濃度、PMA濃度、細胞膜結構等因素影響。結果表明，8 min的暗孵育時間可充分使PMA與DNA結合，曝光處理后與DNA結合形成不可逆的共價交聯結構，抑制死菌DNA擴增。未與DNA結合的PMA曝光時可與水分子反應生成羥胺而失去活性[21-22]。

圖3 暗孵育時間對膜損傷菌的影響Figure 3 Effect of incubation time on heat-treated bacteria

2.2.3 曝光時間的確定 由圖4可知，隨著曝光時間的延長，Ct值逐漸增大，曝光時間為15 min，Ct值增大比較小，當曝光時間延長至20 min，對死菌DNA擴增抑制達到最大，曝光時間為25 min，Ct值幾乎無變化，與曝光時間20 min相比，無顯著性差異(P>0.05)。因此，20 min 的曝光時間可完全抑制死菌DNA擴增，確定最佳的曝光時間為20 min。

圖4 曝光時間對膜損傷菌的影響Figure 4 Effect of light exposure time on heat-treated bacteria

曝光時間是影響活菌檢測的另一個重要因素，光照時間不充分，PMA不能完全被鈍化，部分殘留在菌懸液中，提取DNA時，活細胞的細胞膜被破壞，暴露出的DNA被PMA分子結合，使檢測結果出現假陰性。鹵鎢燈的選擇也會影響到曝光的時間，650 W鹵鎢燈雖然能降低耗時，但同時會產生大量的熱量，有可能造成管口附近菌體的死亡。所以本研究選用500 W的鹵鎢燈距離20 cm，曝光20 min，一方面使與DNA結合的PMA與DNA分子進一步充分交聯，同時使游離的PMA完全被鈍化。

2.2.4 PMA對不同比例活菌和膜損傷菌影響 PMA對不同比例活菌和死菌的影響如表3所示，當樣品全部為死菌時(活菌比例0%)，未加PMA處理的Ct值為16.21，加PMA處理后Ct值為23.28，差異極顯著(P<0.01)，活菌的比例為25%，50%，75%，未加PMA處理的樣品Ct值明顯低于加入PMA樣品的Ct值，說明PMA有抑制死菌DNA擴增的作用。當樣品中活菌比例達到100%時，未加PMA樣品的Ct值與加入PMA處理樣品的Ct值無顯著性差異(P>0.05)，說明加入的PMA對活菌的擴增幾乎無影響。同時，活菌比例的增大導致Ct值相應的減少，說明經PMA處理后死菌DNA被PMA抑制不能擴增，可以消除死菌對PCR的擴增，降低假陽性結果出現的可能性。

表3 不同比例活菌樣品PMA-qPCR結果?Table 3 PMA-qPCR Results of different live bacteria proportion

? △Ct=PMA處理組-對照組。

2.3 質粒標準品的制備及標準曲線的建立

質粒標準品初始拷貝數為6.39×108拷貝/μL。將其進行10倍梯度稀釋，使濃度范圍在1×101～1×108拷貝/μL。以拷貝數對數值和所得Ct值為橫、縱坐標建立標準曲線，見圖5。可以看出兩者存在對應線性關系，r2=0.995 5，斜率為-3.220 4，該方法最低能夠檢出6.39×102拷貝/μL的潰瘍菌。

2.4 PMA-qPCR的靈敏度

菌液10倍梯度稀釋至101，102，103，104，105，106，107，經合適條件的PMA處理提取DNA，進行PMA-qPCR反應。根據標準曲線得到定量結果見表4，PMA-qPCR方法最低可檢出2.38×102拷貝/μL的潰瘍菌見圖6。

2.5 獼猴桃枝條樣品活菌檢測

染菌樣品經PMA處理提取DNA，進行PMA-qPCR檢測，根據標準曲線得到基因拷貝數，與平板計數的結果進行比較，顯示兩者無顯著性差異(P>0.05)(表5)。

圖5 Psa質粒標準曲線Figure 5 Plasmid standard curve

表4 不同稀釋梯度菌液的PMA-qPCR結果?Table 4 PMA-qPCR results of different dilution bacteria

? UD表示未測得。

1～5分別為稀釋至107，106，105，104，103的菌懸液擴增曲線，最低可檢出2.38×102拷貝/μL的潰瘍菌

圖6 PMA-qPCR靈敏度分析
Figure 6 PMA-qPCR sensitivity analysis

表5 染菌樣品PMA-qPCR結果與平板計數結果比較?Table 5 Compare results of PMA-qPCR with plate count

? UD表示未測得。

3 結論

本試驗以獼猴桃潰瘍菌為研究對象，通過優化PMA處理條件，實現檢測陜西獼猴桃潰瘍病優勢病原菌活菌的目的。結果表明，PMA與死菌共價交聯的最佳濃度為105 μg/mL，最佳暗孵育時間為8 min，最佳曝光時間為20 min，在此條件下，Psa死菌擴增被抑制，而活菌的擴增未受影響。同時，雖然優化后的PMA濃度對活菌的擴增未產生影響，但是該濃度相對此類文獻而言還是偏高，所以對于陜西獼猴桃潰瘍病優勢病原菌是否對PMA具有更強的抵抗力，還需要進一步研究。