HTLCS與HPLC測定滁菊中木犀草素、芹菜素、金合歡素方法的建立與比較

周國梁 蔡玉茹 李灑灑 江 倩 馮順麗 秦梅頌 俞 浩

(安徽科技學院生命與健康科學學院，安徽 蚌埠 233100)

滁菊為菊科植物菊(Chrysanthemummorifoliumcv.‘chuju’ )的干燥頭狀花序，為安徽滁州地區的道地藥材[1]，是一種藥食兩用植物[2-3]。滁菊中主要含有黃酮類、揮發油、有機酸和微量元素等成分，具有疏風散熱、平肝明目和清熱解毒等功效。現代研究表明，滁菊對大鼠心肌缺血具有較好的保護作用[4-5]，能夠提高大鼠耐疲勞作用[6]，具有較好的抗氧化性[7-8]。在市場上流通的滁菊質量差異較大，對其質量進行分析和確定有重要意義[9-10]。劉漢珍等[11]采用菊花中總黃酮類成分分析，楊畢超等[12]采用總黃酮類、總糖、總酚酸成分對滁菊質量進行了分析，但是總成分分析在對滁菊質量分析中不能確定有效成分的差異性，因此在有效成分差異性評價方面存在不足。2015版的《中國藥典》中對菊花進行定量分析中僅采用單一成分進行定量分析[2]，中藥中多成分的復雜性決定了單一成分指標評價不能體現滁菊質量的差異性，多成分進行綜合定量分析，并進行評價才能真實體現其質量的差異性[13]。

目前對滁菊質量成分分析多采用高效液相色譜法(HPLC)，但該法樣品前處理復雜，耗費時間長，不能滿足現有食品快速檢測分析質量管理的要求[14]。高效薄層色譜掃描法(HTLCS)具有分離分析雙重功能[15-16]，對樣品的預處理要求不高[17-18]，可以在同一塊硅膠板上點樣多個樣品，能夠同時展開分析，展開劑可以根據分離效果進行調配[19-20]，選擇范圍寬且用量少，更換方便，使用條件相對簡單[21-22]。目前HTLCS法還未被應用于滁菊中木犀草素、芹菜素和金合歡素3種成分的測定。本試驗擬建立滁菊木犀草素、芹菜素和金合歡素3種主要成分HPLC和HTLCS的分析方法，同時對其進行定量分析，并進行綜合評價，考察HTLCS法是否可以替代HPLC法用于滁菊中3種成分的分析，以便快速準確地分析滁菊中成分差異性，為保障滁菊的安全應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

木犀草素對照品(批號1309-08)、芹菜素對照品(批號15032610)：中國食品藥品檢定研究院；

金合歡素對照品：純度≥99.0%，上海詩丹德科技生物有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Sigam 公司；

其他試劑均為分析純；

滁菊：共6個批號，批號分別為20171106(S1)，20171126(S2)，20171208(S3)，20180115(S4)，20180214(S5)，20180316(S6)，安徽滁州菊泰有限公司，經安徽科技學院中藥學教研室劉漢珍教授鑒定均為正品滁菊。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：LC-20AT型，包括SIL-30AC自動進樣器、CTO-10A柱溫箱、SPD-M20A檢測器和Lab Solutions型色譜工作站，日本島津公司；

半自動點樣儀：LINOMAT5型，瑞士CAMAG公司；

薄層色譜成像文件系統：HTLC VISALIZER型，瑞士CAMAG公司；

薄層色譜掃描儀：HTLC SCANNER 3型，瑞士CAMAG公司；

薄層硅膠板：HTLC GF254型，青島海洋化工有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9140型，上海三發科學儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-6型，常州普天儀器制造有限公司；

電熱套：ZNHW-Ⅱ型，鄭州科華儀器設備有限公司。

1.2 高效液相色譜法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取滁菊1.000 g，剪碎，加石油醚(30%～60%)20 mL超聲處理30 min，過濾，藥渣揮發石油醚后加稀鹽酸1 mL與乙酸乙酯50 mL超聲處理30 min。過濾，濾液水浴蒸干，得到的殘渣加甲醇2 mL 使其溶解，5 000 r/min離心20 min后取上清液定容于10 mL容量瓶中得供試品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取標準品，配成標準品濃度為木犀草素0.48 mg/mL、芹菜素0.48 mg/mL、金合歡素0.24 mg/mL的混合對照品貯備溶液，分別精密吸取上述標準溶液各0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL置10 mL 容量瓶中，混勻后用甲醇稀釋到刻度，即得5種不同濃度的混合對照品溶液。

1.2.3 色譜條件與適應性試驗 色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈(A)—0.1%磷酸(B)梯度洗脫，按表1所示進行洗脫，檢測波長365 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣10 μL，分別記錄混合對照品溶液色譜圖和樣品溶液色譜峰圖，對色譜峰和基線關系進行分析，并計算分離度、拖尾因子和理論塔板數。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3 高效薄層掃描法

1.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取滁菊1.000 g，剪碎，加石油醚(30%～60%)20 mL超聲處理30 min，過濾，藥渣揮發石油醚后加稀鹽酸1 mL與乙酸乙酯50 mL超聲處理30 min。過濾，濾液水浴蒸干，得到的殘渣加甲醇2 mL 使其溶解，轉移到5 mL容量瓶中搖勻，作為供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取標準品，加甲醇配成濃度為木犀草素0.66 mg/mL、芹菜素0.65 mg/mL、金合歡素0.32 mg/mL混合對照品儲備溶液，分別吸上述混合對照品溶液各0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL 置10 mL 容量瓶中后用甲醇定容至刻度，即得5種不同濃度的混合對照品溶液。

1.3.3 HTLC層析及薄層掃描條件 HTLC薄層硅膠板(20 cm×10 cm)，條狀點樣，點樣量為4 μL，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸∶水=17∶7∶3∶2上層溶液為展開劑上行展開80 mm，取出，晾干，用AlCl3噴霧顯色，在365 nm波長對硅膠板進行拍照，并在340 nm波長下進行直線掃描并進行掃描分析，狹縫寬度為6.0 mm×0.3 mm，測量供試品吸光度積分值和對照品吸光度積分值。

1.4 數據處理

數據采用Excel 2010整理；運用SPSS Statistics V 19.0 等軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 高效液相色譜圖及系統適應性試驗 根據高效液相色譜條件，分別對混合對照品及樣品溶液進行分析，并記錄色譜圖，其色譜圖見圖1，從分析色譜峰可以看出基線平穩，色譜峰之間分離性好，測定成分之間無相互干擾，根據色譜峰圖計算木犀草素、芹菜素和金合歡素3種物質的分離度均>1.5，拖尾因子分別為0.95，0.98，1.02，理論塔板數分別為2 216，4 986，9 772，表明系統適應性良好符合要求。

2.1.2 線性關系的考察 按照1.2.3方法，每個標準混合對照品溶液分別進樣20 μL進行分析測定。以進樣濃度(μg/g)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，結果得木犀草素、芹菜素、金合歡素標準曲線回歸方程見表2，根據建立線性回歸方程相關系數r>0.999，說明范圍內線性關系良好。

1.木犀草素 2.芹菜素 3.金合歡素

表2 標準曲線回歸方程Table 2 Standard curve regression equation

2.1.3 精密度試驗 取同一混標溶液，按所述色譜條件測定，分別在同一天重復進樣6次，每次進樣3 μL，計算各色譜峰的峰面積，進而計算各標準品的RSD。按所述色譜條件，測定木犀草素、芹菜素、金合歡素的峰面積的RSD分別為0.60%，0.54%，0.41%；表明該儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 對照品溶液置于4 ℃冰箱中，分別在0，4，8，12，16，24 h后吸取對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀中，測定峰面積積分值。結果表明，木犀草素、芹菜素、金合歡素的峰面積的RSD分別為1.5%，1.3%，1.0%，對照品在24 h內穩定性良好。

2.1.5 重復性試驗 取同一批樣品6份，精密稱定，按1.2.3 的方法制備供試品溶液，分別進樣20 μL測定。測得木犀草素、芹菜素、金合歡素的峰面積的RSD分別為1.4%，1.1%，1.3%，結果表明方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品6份，分別加入一定量的混合對照品溶液，按1.2.1的方法制備供試品溶液，依法操作，測定其峰面積，計算回收率，結果見表3。由表3可知木犀草素、芹菜素、金合歡素的平均回收率分別為99.8%，100.3%，100.1%；RSD分別為1.45%，1.32%，1.30%，表明該方法回收率良好。

2.2 高效薄層掃描法

2.2.1 高效薄層層析及薄層掃描 HTLC薄層硅膠板在365 nm處拍照結果見圖2，并對木犀草素、芹菜素、金合歡素對照品斑點及供試品中相應的斑點在340 nm波長下進行直線掃描檢測，結果見圖3。從圖2和圖3中可以看出混合標品和供試品中3種物質成分分離較好，相互干擾小，表明在分析條件符合定量要求。可以對3種成分進行定量分析。

2.2.2 線性關系考察 使用半自動點樣儀分別吸取木犀草素、金合歡素和芹菜素混合對照品溶液，以點樣量2 μL分別點于HTLC薄層硅膠板上，進行展開、成像、掃描。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 Test results of sample recovery (n=6)

1.木犀草素 2.金合歡素 3.芹菜素 S1～S6為不同批次滁菊樣品 7～8.混合標準品

圖2 混合對照品及供試品高效薄層色譜圖
Figure 2 HTLCS of reference and test samples

以點樣濃度為橫坐標(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。由表4可知，木犀草、芹菜素、金合歡素在進樣量范圍內，點樣量與峰面積積分值有良好的線性關系。

表4 標準曲線回歸方程Table 4 Standard curve regression equation

1.木犀草素 2.芹菜素 3.金合歡素

2.2.3 同板精密度試驗 精密吸取木犀草素、芹菜素、金合歡素對照品溶液，于薄層板上各點6個條帶，每條帶2 μL，按薄層色譜條件展開后掃描，測定木犀草素、芹菜素、金合歡素峰面積積分值的RSD分別為1.40%，1.57%，1.59%，表明該方法精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 在同一HTLC薄層硅膠板上交叉點對照品溶液1，2，3 μL，供試品溶液2 μL，按色譜條件及掃描條件對對照品進行測定，每隔30 min掃描一次，結果峰面積積分值在2.5 h內基本保持不變，RSD分別為1.23%，1.070%，1.50%，表明2.5 h內穩定性良好。

2.2.5 重復性試驗 按1.3.1方法制備相同濃度的供試品溶液6 份，分別測定木犀草素、芹菜素、金合歡素的含量，結果表明木犀草素、芹菜素、金合歡素峰面積積分值的RSD分別為1.50%，1.67%，1.69%，表明該方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的供試品溶液3份200 μL，各加入對照品200 μL，均勻混合。采用定量點樣器吸取混合液2 μL同時點樣于硅膠板上，按照1.3.3 方法進行展開并進行樣品掃描測定，計算回收率和RSD，結果見表5。由表5可知，木犀草素、芹菜素、金合歡素測定的平均回收率分別為99.90%，100.65%，101.30%；RSD分別為1.55%，1.41%，1.64%，表明該方法回收率良好。

2.3 高效液相色譜法與薄層掃描法測定滁菊中木犀草素、芹菜素、金合歡素的含量

采用HTLCS和HPLC法對滁菊6個批次產品中3種成分進行測定，并對2種方法測定成分進行計算，并對2種方法的誤差RE進行分析，結果見表6。由表6可知，基于滁菊中3種成分測定中RE<3%，表明2種方法測定誤差較小。對3種成分分別采用獨立樣本t檢測，結果顯示3種成分采用2種方法檢測無顯著性差異(P>0.05)。

表5 加樣回收率試驗結果Table 5 Test results of sample recovery (n=6)

表6 HTLCS與HPLC法測定滁菊批次成分3種成分含量結果比較?Table 6 Comparison of content determination by HPLC and HTLCS (n=3)

?RE=(HTLCS法測定值-HPLC法測定值)÷HTLCS法測定值×100%。

3 結論

(1)本試驗分別建立高效液相色譜法與高效薄層掃描法測定滁菊中木犀草素、芹菜素、金合歡素的含量，并對滁菊不同批次產品采用2種方法測定結果進行比較分析，組間比較無差異性(P<0.05)，且RE<3%，表明HTLCS法可以代替HPLC法對滁菊中3種成分進行分析，且分析誤差較小。

(2)本試驗采用HTLCS法和HPLC法同時對滁菊中3種成分分析，并對測定方法建立了相關分析方法，測定方法的線性關系及相關方法學考察符合要求，本試驗對滁菊中多成分分析方面更能體現滁菊質量差異性，測定方法較唐婧等[23]采用HPLC法對滁菊中單一成分木犀草素評價更具有科學性。

(3)滁菊為藥用植物，含有效成分較多，僅對其中幾個進行分析對其質量評價存在局限性，采用分析方法對滁菊中更多有效成分進行分析有待下一步研究。