電子束變性處理對大米蛋白酶解效率的影響

張新霞 陳正行 王 莉

(1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

大米蛋白是最接近FAO/WHO理想模式的植物蛋白，氨基酸組成配比合理，生物價高，過敏性低，是一種優質谷物蛋白[1]。近年研究[2-3]發現，大米蛋白具有重要保健功能，如抗糖尿病、抗膽固醇、抗癌變等。盡管大米蛋白的營養價值和保健價值已被認可，但低溶解性嚴重限制了其在工業中的應用。酶解改性可以較好地改善大米蛋白的溶解性，使水解產物具有各種生物活性[4]。然而，大米蛋白分子結構緊密，具有高疏水性，對蛋白酶的水解作用有較強的抵抗力，現有資料[5-8]顯示，在適宜的酶解條件下，利用不同的蛋白酶水解大米蛋白，其水解度為10%～20%，制約了大米蛋白酶解改性的實際效果，也導致利用酶法制備活性肽時產率較低。因此，尋求大米蛋白高效水解技術是大米蛋白酶法改性的關鍵。目前很多學者通過物理手段提高酶解效率，如超聲波[5,9]、微波[10-11]、超高壓[12-13]和電子束輻照[14-15]等。

電子束輻照(electron beam irradiation,EBI)是一種新型的冷處理改性技術，與其他物理手段相比，EBI技術參數簡單(只需控制處理劑量)，易控制且操作簡便，非常適合工業化應用。EBI作用可使蛋白質表面微觀結構和空間構象發生改變。林松毅等[14]發現EBI處理劑量為3.24 kGy 時，玉米蛋白的表面完整性明顯降低，緊密結構被打開。Lv等[16]研究了EBI變性處理對肌原纖維蛋白的影響，結果表明1 kGy處理劑量使α-螺旋含量下降，但繼續增加EBI處理劑量，α-螺旋含量增加。Zhao等[17]發現EBI處理劑量為0～15 kGy時，核桃蛋白的非結晶結構未發生變化，但其表面完整性下降，熱穩定性增加。Wang等[18]利用EBI變性技術處理小麥胚芽蛋白，結果發現EBI變性處理能降低小麥胚芽蛋白的表面疏水性，并使其二級結構中的有序α-螺旋結構向無規則卷曲轉化。上述研究表明EBI變性處理能改變蛋白結構，但可能會對蛋白酶解產生影響。然而，目前關于EBI技術對蛋白酶解敏感性的報道較少[14]，而關于EBI變性處理改變蛋白質酶解效果的構效關系尚未見報道。

大米蛋白是植物蛋白中疏水性最強者，本研究擬以大米蛋白為例，研究新型EBI冷處理蛋白質變性技術，探索其提高酶解性能的作用機理，為植物蛋白的開發利用提供新途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米蛋白：無錫金農生物科技有限公司；

堿性蛋白酶：13.8萬U/g，諾維信(中國)生物技術有限公司；

中性蛋白酶：7.5萬U/g，諾維信(中國)生物技術有限公司；

復合蛋白酶：12.5萬U/g，諾維信(中國)生物技術有限公司；

胰蛋白酶：8.7萬U/g，中國醫藥集團上海化學試劑公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子加速器：5.0 MeV型，無錫愛邦電子加速器公司；

氨基酸分析液相色譜儀：L-8800型，日本Hitachi公司；

掃描電鏡：TM-3030型，日本Hitachi公司；

FTIR光度計：Nicolet iS10型，美國ThermoFisher公司；

熒光光度計：F-7000型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 EBI變性處理大米蛋白 將大米蛋白粉裝入自封袋(聚乙烯)中，使其鋪平后厚度約為1 cm。采用 5.0 MeV 電子加速器進行輻照，束流2 mA，傳送速率6 m/min，輻照吸收劑量分別為5，10，20，30，40 kGy，輻照后的樣品儲存于-20 ℃備用。

1.2.2 大米蛋白酶解 選用4種蛋白酶進行水解，其各自最適酶解條件由商家提供，堿性蛋白酶(pH 8.5，55 ℃)，中性蛋白酶(pH 7.0，45 ℃)，復合蛋白酶(pH 7.0，50 ℃)，胰蛋白酶(pH 8.0，50 ℃)。蛋白酶的最適添加量通過前期預試驗確定。將大米蛋白配成5 g/100 mL 懸液，在4種酶的最適酶解條件下攪拌30 min，使其充分分散。然后加入蛋白酶進行水解120 min。蛋白酶與大米蛋白的比例為1∶100(質量比)。通過加入1 mol/L NaOH溶液控制水解過程中溶液pH。反應結束后，沸水浴中滅酶10 min。將水解液pH調至中性后，10 000 r/min離心20 min。上清液冷凍干燥后儲存于-20 ℃備用。水解過程中的水解度按式(1)計算：

(1)

式中：

B——消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；

Mb——氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；

α——蛋白平均的解離程度，1/α=1.01；

Mp——水解的蛋白質的質量，g；

htot——蛋白質基質肽鍵總數(對于大米蛋白取7.4 mmol/g)。

1.2.3 多肽產率測定 取步驟1.2.2中離心后上清液，與等體積10 g/100 mL三氯乙酸充分混合，4 ℃靜置30 min，8 000 r/min 離心5 min，采用考馬斯亮藍法測定上清液中多肽含量。多肽產率為上清液中多肽的質量與原料蛋白中蛋白的量的比值。

1.2.4 電子掃描電鏡 將蛋白樣品置于導電膠表面，進行噴金處理。采用掃描電鏡觀察樣品的微觀結構。

1.2.5 傅里葉紅外光譜(FTIR) 稱取2～3 mg粉末樣品與適量KBr混合并充分研磨，用壓片機壓成透明小塊，采集FTIR圖譜。采集參數為分辨率2 cm-1，掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數32次。利用PeakFit 4.12對FTIR圖譜中酰胺Ⅰ區(1 700～1 600 cm-1)進行解析，得到蛋白質4種二級結構含量。

1.2.6 紫外光譜 用0.01 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液配制終濃度為2.0 mg/mL蛋白溶液。用紫外—可見分光光度計采集紫外光譜。采集參數為波長范圍200～400 nm，步長2.0 nm，速度60 nm/min，以磷酸緩沖液作空白。

1.2.7 內源熒光光譜 用0.01 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液配制終濃度為0.04 mg/mL蛋白溶液，采集內源熒光光譜。采集參數為波長范圍300～500 nm，激發波長280 nm，步長2.5 nm，速度10 nm/s，以磷酸緩沖液作空白。

1.2.8 數據分析 數據結構形式均為均值±SD。采用SPSS對數據進行分析，采用Duncan多范圍測試分析顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 EBI變性處理對大米蛋白水解度的影響

由圖1可知，EBI處理組大米蛋白初始水解速率快，DH值明顯增加，堿性蛋白酶和復合蛋白酶水解過程中，DH值隨EBI處理劑量的升高快速增加。而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解過程中，隨著EBI處理劑量的增加，DH值增長比較緩慢。EBI處理劑量30 kGy，水解120 min時，不同蛋白酶對大米蛋白的水解度均達到最大值，DH值分別增加(19.02±0.37)%(堿性蛋白酶)，(16.71±0.48)%(復合蛋白酶)，(11.44±0.39)%(中性蛋白酶)，(7.26±0.50)%(胰蛋白酶)。在相同的EBI處理劑量下，不同種類的蛋白酶水解的大米蛋白的DH值增加程度不同，與蛋白酶的特異性有關。堿性蛋白酶和中性蛋白酶是非特異性內切酶，酶切位點廣泛；復合蛋白酶含有內切蛋白酶和外切肽酶，作用位點較多；胰蛋白酶是特異性內切酶，只作用于Lys和Arg殘基中的羧基端，酶切位點有限。當大米蛋白在EBI作用下結構發生改變時，作為底物，與具有廣泛特異性的酶的相互作用效果比與限制性內切酶的作用效果要好。

圖1 EBI處理劑量和蛋白酶種類對大米蛋白酶解進程的影響Figure 1 Effect of irradiation does and enzyme type on enzymatic hydrolysis of rice protein

2.2 EBI變性處理對多肽產率的影響

由表1可知，采用堿性蛋白酶和復合蛋白酶對大米蛋白進行水解，變性處理劑量為10～30 kGy時，多肽產率隨EBI變性處理劑量的增加而顯著上升，變性處理劑量為30 kGy時，多肽產率分別增加(13.5±0.29)%和(8.19±0.38)%，當變性處理劑量繼續增加時，多肽產率無顯著性變化。而采用中性蛋白酶和胰蛋白酶對大米蛋白進行水解，變性處理劑量為5，10 kGy時，多肽產率增加效果不顯著(P>0.05)，當變性處理劑量為30 kGy時，大米蛋白多肽產率由(53.62±0.89)%(中性蛋白酶)和(64.16±1.21)%(胰蛋白酶)分別顯著提高至(55.73±1.05)%和(66.92±1.12)%。

2.3 EBI變性處理對大米蛋白表面形態的影響

由圖2可知，大米蛋白的微觀表面結構在EBI變性處理前后發生了明顯的變化。未經EBI變性處理的大米蛋白為致密的球狀結構，表面凹凸不平，存在細小的裂痕和孔隙，但整體完整性較好。經EBI變性處理的大米蛋白表面結構發生了明顯的變化。當變性處理劑量增加至30 kGy時，大米蛋白微觀表面完整性被破壞，大量小球形顆粒附著于大顆粒上，顆粒變的疏松。可能是EBI產生的能量使蛋白質分子間的氫鍵和范德華力發生斷裂，破壞蛋白質分子間的交聯。結果表明，隨著EBI變性處理劑量的增加，大米蛋白致密的球狀結構被打開，比表面積增加。由于表面的孔隙和小顆粒數量的增加，大米蛋白作為底物在酶解過程中與蛋白酶接觸的表面積增加，使其更容易被水解。另外，孔隙結構也有利于蛋白酶進入底物顆粒內部，使肽鍵斷裂，產生更多小分子肽[19]。掃描電鏡的結果可從宏觀角度解釋EBI變性處理提高大米蛋白水解度的原理。

表1 EBI變性處理劑量對不同酶水解產物多肽產率的影響?Table 1 Effect of irradiation does on peptide production of rice protein hydrolysates obtained by various enzyme (n=3) %

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同EBI變性處理劑量下大米蛋白掃描電子顯微鏡圖Figure 2 The SEM picture of rice protein pretreated with different irradiation

2.4 EBI變性處理對大米蛋白二級結構的影響

1 700～1 600 cm-1的FTIR圖譜為蛋白質二級結構的特征振動峰，通過軟件對其結構進行解析(表2)發現，大米蛋白的二級結構含量在EBI變性處理前后發生了明顯的變化。當變性處理劑量為5～30 kGy時，EBI變性處理組的大米蛋白的α-螺旋結構含量隨變性處理劑量增加顯著下降，而β-折疊、β-轉角和無規則卷曲結構含量呈上升趨勢。EBI變性處理劑量為30 kGy時，α-螺旋結構含量降低了75.73%，而β-折疊、β-轉角和無規則卷曲結構的含量分別增加了16.63%，10.70%，24.77%。繼續增加變性處理劑量，蛋白質二級結構含量變化不顯著(P>0.05)。在蛋白質的4種二級結構中，α-螺旋為致密的有序結構，β-折疊、β-轉角屬于相對舒展的有序結構，而無規則卷曲則為無序結構[16,20]。EBI變性處理使大米蛋白中致密的α-螺旋結構向相對舒展的β結構以及無序的無規則卷曲結構轉化，說明EBI作用破壞了大米蛋白緊密的分子結構，使分子結構變動靈活疏松，更有利于蛋白質與酶接觸，從而增強酶解效果。

2.5 紫外可見光光譜分析

由圖3(a)可知，EBI作用后，大米蛋白的特征紫外吸收峰隨變性處理劑量的增加呈先增強后減弱的趨勢，但都遠大于變性處理前的水平。說明EBI變性處理使大米蛋白分子展開，內部顯色團外露，但當變性處理劑量增加到一定程度時，蛋白質分子出現重新聚集的趨勢，導致吸收峰強度下降。200 nm處的特征吸收峰由肽鍵貢獻[21]，EBI變性處理后，其吸收強度增加，表明大米蛋白經EBI變性處理后其肽鍵的空間結構發生改變，更多的肽鍵暴露到分子表面參與酶解反應。

表2 蛋白二級結構百分含量?Table 2 Results of secondary structure analysis by FTIR (n=3) %

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖3 EBI變性處理前后蛋白質的紫外可見光光譜分析Figure 3 The UV spectra of protein with or without EBI treatment

由圖3(b)可知，當氨基酸殘基所處的微環境疏水性下降時，其紫外吸收二階導光譜特征峰向低波數遷移(藍移)[22]。270～282 nm處吸收峰歸屬于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨基酸殘基，其λmax從279 nm藍移至276 nm(30 kGy)；288 nm處吸收峰由色氨酸和酪氨酸殘基共同貢獻，EBI作用使其發生3 nm藍移(30 kGy)。吸收峰的藍移說明EBI變性處理后的大米蛋白分子展開，芳香族氨基酸殘基所處的微環境更加親水，與蛋白酶作用的空間位阻下降，從而使酶解效率提高。

2.6 內源熒光光譜分析

由圖4可知，隨著EBI變性處理劑量的增加，大米蛋白的最大吸收波長向長波長方向移動，在變性處理劑量為30 kGy時，紅移程度最大(由335 nm紅移至347 nm)。紅移程度越大，說明蛋白質空間構象的變化程度越大，蛋白質分子更加伸展[23-24]。結合圖3(b)表明大米蛋白的空間構象發生變化，EBI作用使蛋白質分子空間構象展開，內部疏水區的酶切位點暴露，參與酶解反應。

圖4 EBI變性處理前后蛋白質的內源熒光光譜Figure 4 The intrinsic fluorescence spectrum of protein with or without EBI treatment

3 結論

EBI變性處理能有效提高大米蛋白的酶解效率和多肽產率。不同蛋白酶對EBI變性大米蛋白的水解度不同：堿性蛋白酶>復合蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶，其中EBI輔助堿性蛋白酶水解效果最好，大米蛋白水解度提高(19.02±0.37)%，多肽產率提高(13.50±0.29)%。表面形態分析表明，EBI變性處理使致密的大米蛋白顆粒變得疏松，顆粒化程度增加；此外，EBI變性技術使蛋白質二級結構發生重組，致密的α-螺旋結構向舒展的β結構和無序結構轉化，使蛋白分子靈活性增加；紫外光譜和內源熒光光譜分析表明，EBI變性技術使大米蛋白分子空間構象展開，暴露出更多包埋在內部疏水區域的活性基團。EBI變性處理導致的大米蛋白結構的變化，既增加了蛋白質與酶接觸的比表面積，又釋放出更多的酶切位點，從而提高了酶解效率。目前，對動植物蛋白進行適度酶解是改善其溶解性、乳化性、起泡性以及抗氧化性等生理活性的重要手段。通過酶法改性能夠提高蛋白資源的利用率，提升其資源價值。但隨著水解程度的加深，蛋白酶解物的功能性質和生理活性不會無限增加，當水解度達到一定程度時，其功能性質和生理活性出現下降的趨勢。本研究發現EBI變性處理能有效提高大米蛋白的酶解效率，提高多肽產率，因此，后續可對經過EBI變性處理的大米蛋白酶解物的功能性質和生理活性進行深入研究，以擴大大米蛋白的利用率。