富硒碎米薺不同提取物抗氧化性能研究

杜朝東 朱 松 于 添 叢 欣 陳尚衛(wèi)

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.恩施德源健康科技發(fā)展有限公司，湖北 恩施 445000)

硒作為人體必需的微量元素，具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]等生物活性。有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，硒作為體內(nèi)抗氧化蛋白的重要組成部分，在清除活性氧、抑制自由基對(duì)細(xì)胞的損害等方面起著重要的作用?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)硒的含量來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)硒蛋白的活性。雷紅靈等[6]發(fā)現(xiàn)碎米薺硒蛋白在小鼠體內(nèi)能夠明顯地提高體內(nèi)硒酶含量，降低丙二醛含量，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

堇葉碎米薺作為一種十字花科超富硒植物，其硒含量高達(dá)1 414 mg/kg，遠(yuǎn)高于富硒酵母[7]、富硒小麥[8]、富硒大豆[9]等。堇葉碎米薺幼嫩的莖葉可以食用，當(dāng)植株成熟后，其硒含量達(dá)到最高，但由于此時(shí)植株具有特殊氣味令人難以接受，直接食用較少[10]。有學(xué)者[11-12]通過(guò)溶劑提取方式對(duì)堇葉碎米薺進(jìn)行加工利用，制得高硒含量、氣味可接受的碎米薺提取物。目前對(duì)堇葉碎米薺提取物的研究主要集中在其硒蛋白的功能性及硒的形態(tài)上[13-15]，對(duì)碎米薺粗提物和碎米薺硒多肽的生物活性研究甚少。富硒物質(zhì)的體外抗氧化活性是研究其生物活性重要組成部分，通過(guò)研究碎米薺富硒提取物的體外抗氧化活性，能夠比較幾種碎米薺提取物的抗氧化活性強(qiáng)弱。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蓳葉碎米薺、富硒酵母：湖北省恩施德源健康科技發(fā)展有限公司；

氫氧化鈉、硼氫化鉀、鐵氰化鉀、氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸鉀、三羥甲基氨基甲烷：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、硝酸、高氯酸：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸：純度>99%，美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-10N型，寧波生物科技有限公司；

雙功能水浴振蕩器：SHA-B型，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；

可見光分光光度計(jì)：721N型，上海儀電分析儀器有限公司；

臺(tái)式低速離心機(jī)：TD6型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

原子熒光光譜儀：AF-600型，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CE的制備 將碎米薺整株烘干打粉，過(guò)80目篩，稱取4.000 0 g碎米薺粉末，按照料液比1∶40 (g/mL)加入正己烷50 ℃攪拌脫脂4 h，抽濾，將粉末用0.1 mol/L的NaOH溶液，按照料液比1∶40 (g/mL)在50 ℃下攪拌提取8 h，2 850×g離心10 min，上清液旋蒸濃縮4倍體積后冷凍干燥得到碎米薺提取物。

1.2.2 SPR的制備 參考1.2.1，在上清液旋蒸濃縮4倍體積后用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)(pH 2.9)，4 ℃靜置過(guò)夜，2 850×g離心10 min，經(jīng)沉淀冷凍干燥得到碎米薺富硒蛋白。

1.2.3 SPI的制備 稱取4.000 0 g碎米薺蛋白，按照料液比1∶20 (g/mL)加入去離子水，堿性蛋白酶400 μL，溫度55 ℃，pH 8.0，酶解3 h，90 ℃滅酶10 min，3 000 r/min離心10 min，冷卻至溫度50 ℃，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加入中性蛋白酶400 μL，酶解3 h，90 ℃滅酶10 min，3 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)超濾(超濾膜孔徑為5 kDa)收集透過(guò)液，旋蒸濃縮4倍體積后冷凍干燥得到碎米薺多肽。

1.2.4 SPIS的制備 選用非富硒大豆肽與Na2SeO3，制備方法在文獻(xiàn)[16]基礎(chǔ)上略有修改，將大豆肽與Na2SeO3的質(zhì)量比改為9∶1。

1.2.5 總硒含量的測(cè)定 參考GB 5009.93—2017，略有改動(dòng)：負(fù)高壓270 V，燈電流60 mA，輔助氣流量(Ar1)300 mL/min，載氣流量(Ar2)800 mL/min，原子化方式為火焰法，輔助陰極電流80 mA，原子化溫度300 ℃，載流為10% HCl溶液，KBH4濃度10 g/L，讀數(shù)時(shí)間15 s。

1.2.6 有機(jī)硒含量的測(cè)定 采用高效液相色譜串聯(lián)原子熒光光譜儀(HPLC-AFS)的方法測(cè)定樣品中的無(wú)機(jī)硒，詳細(xì)條件如下：負(fù)高壓320 V，原子化溫度300 ℃，燈電流90/0 mA(主/輔)，泵1轉(zhuǎn)速30 r/min，泵2轉(zhuǎn)速20 r/min，輔助氣流量(Ar1)100 mL/min，載氣流量(Ar2)600 mL/min，流動(dòng)相為40 mmol/L的KH2PO4和20 mmol/L 的KCl等量均勻混合，消解液為0.15%的KI溶液，載流為10% HCl溶液，KBH4濃度20 g/L，色譜柱為PRP-X100 10 μm 4.1 mm×250 mm，采用等度洗脫的方式，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。按式(1)計(jì)算有機(jī)硒含量。

有機(jī)硒含量(mg/kg)=總硒含量(mg/kg)-無(wú)機(jī)硒含量(mg/kg)。

(1)

1.2.7 DPPH·清除率的測(cè)定 參考圣志存等[17]的方法，改動(dòng)如下：用無(wú)水乙醇代替無(wú)水甲醇配置DPPH溶液，DPPH溶液濃度由0.15 mmol/L改為0.1 mol/L，將待測(cè)樣品溶液與的DPPH溶液混合比例由1∶3改為1∶1。

1.2.8 ABTS+·清除率的測(cè)定 參考董竹平等[18]的方法，改動(dòng)如下：將ABTS+工作液的添加量由1.5 mL增加至4 mL。

1.2.10 OH·清除率的測(cè)定 參考李亞男等[20]的方法，改動(dòng)如下：在加入H2O2后，37 ℃恒溫時(shí)間由30 min延長(zhǎng)至60 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，使用SPSS 23對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品中總硒及有機(jī)硒含量的測(cè)定

由于樣品中不同價(jià)態(tài)硒的種類眾多，直接檢測(cè)各價(jià)態(tài)硒的含量較為困難，所以采用HPLC-AFS法，先用HPLC將不同價(jià)態(tài)的硒分離[21]，然后經(jīng)AFS測(cè)定不同價(jià)態(tài)硒的含量。由于一些含硒物質(zhì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且某些有機(jī)硒分離較困難，而無(wú)機(jī)硒種類較少，分離簡(jiǎn)單，所以采用總硒減無(wú)機(jī)硒的方式間接測(cè)定有機(jī)硒含量[22]。圖1為5種常見硒形態(tài)的色譜分離圖，其中對(duì)無(wú)機(jī)硒[Se(IV)、Se(VI)]與有機(jī)硒(SeCys2、MeSeCys、SeMet)的分離效果較好，能夠?qū)o(wú)機(jī)硒進(jìn)行定量。如表1所示，通過(guò)比較每種含硒物質(zhì)之間的總硒及有機(jī)硒含量差異，發(fā)現(xiàn)IS和SPIS的總硒含量和無(wú)機(jī)硒遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他4種含硒物質(zhì)，而SPI、SPR、CE和SY的有機(jī)硒含量遠(yuǎn)高于IS和SPIS，在3種碎米薺提取物中CE的有機(jī)硒含量最高，其次為SPI。通過(guò)比較每種含硒物質(zhì)的總硒及有機(jī)硒含量，發(fā)現(xiàn)IS和SPIS未檢測(cè)出有機(jī)硒，其硒的形態(tài)主要以無(wú)機(jī)硒形式存在，CE中含有少量的無(wú)機(jī)硒，而SPI、SPR和SY中的硒主要以有機(jī)硒的形式存在。說(shuō)明在提取得到的含硒物質(zhì)中通過(guò)純化可降低無(wú)機(jī)硒含量，使產(chǎn)物中的硒以有機(jī)硒形式存在。

1.SeCys2 2.MeSeCys 3.Se(IV) 4.SeMet 5.Se(VI)

表1 不同含硒物質(zhì)總硒及有機(jī)硒含量Table 1 The content total selenium and organic selenium in different selenium sources mg/kg

2.2 不同含硒物質(zhì)抗氧化性

2.2.1 清除DPPH·能力 由圖2所示，不同含硒物質(zhì)清除DPPH·能力隨硒濃度的增大而增加，清除能力強(qiáng)弱依次為：SPI>CE>SY>SPR>SPIS>IS。其中SPI對(duì)DPPH·的清除能力高于其他5種含硒物質(zhì)且差異較大。CE、SPI、SPR和SY中硒主要以有機(jī)硒的形態(tài)存在[10]，而SPIS和IS中硒以無(wú)機(jī)硒的形態(tài)存在。另外SPI、CE、SPR、SPIS和SY的清除DPPH·的IC50分別為1 194，3 368，4 835，37 586，2 983 μg/L。說(shuō)明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有機(jī)硒清除DPPH·能力強(qiáng)于無(wú)機(jī)硒。其中相同濃度下SPI抗氧化能力最強(qiáng)，可能是多肽分子量較小，活性成分充分暴露，與自由基接觸，從而降低自由基含量[21]；姚昭等[22]以大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，研究有機(jī)硒與無(wú)機(jī)硒的抗氧化能力的不同，發(fā)現(xiàn)有機(jī)硒較無(wú)機(jī)硒能明顯增強(qiáng)大鼠體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性，顯著的增強(qiáng)大鼠體內(nèi)抗氧化能力。

圖2 不同含硒物質(zhì)對(duì)DPPH·清除能力比較Figure 2 The DPPH radicals scavenging ability of different selenium sources

2.2.2 清除ABTS+·能力 由圖3所示，不同含硒物質(zhì)清除ABTS+·能力隨硒濃度的增大而增加，SPI、CE、SY、SPR、SPIS、IS對(duì)ABTS+·的清除能力依次減弱。SPI、CE、SPR、SPIS、SY、IS清除ABTS+·的IC50分別為914.3，2 253，11 957，42 414，10 900，160 332 μg/L。其中SPIS和IS的ABTS+·清除能力在相同濃度下相差不大，但二者的抗氧化能力均明顯弱于SPI、CE、SY和SPR。所以導(dǎo)致其清除自由基能力較強(qiáng)。鄭時(shí)蓮等[23]也發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉清除ABTS+·的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硒酵母等物質(zhì)。

圖3 不同含硒物質(zhì)對(duì)ABTS+·清除能力比較Figure 3 The ABTS+ radicals scavenging ability of different selenium sources

圖4 不同含硒物質(zhì)對(duì)清除能力比較Figure 4 The radicals scavenging ability of different selenium sources

2.2.4 清除OH·能力 如圖5所示，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，6種物質(zhì)對(duì)OH·的清除率隨硒濃度的增加而增強(qiáng)，其中SPI清除OH·的能力最強(qiáng)，在硒含量為7 000 μg/L 時(shí)為50.3%，其次為CE，然后依次為SY、SPIS、SPR，IS對(duì)OH·清除率最低為3.7%。各組分對(duì)OH·清除能力差異較大，且以SPI清除能力最強(qiáng)，其中由于CE為碎米薺直接提取物，未進(jìn)行分離純化，其成分復(fù)雜，既含有蛋白、多糖等大分子物質(zhì)，又含有少量多酚、黃酮類物質(zhì)，可能由于其中抗氧化成分較多[25]。而SY為富硒酵母，測(cè)定時(shí)主要為其水提液中自由基清除劑與自由基反應(yīng)。SPR為經(jīng)純化后的硒蛋白，具有一定能與自由基反應(yīng)的基團(tuán)，但其活性部位未能充分地與自由基反應(yīng)，所以SPR的抗氧化能力與SPI相比要弱。SPIS和IS抗氧化能力較弱，可能是由于其中的硒為無(wú)機(jī)硒，而大豆多肽與無(wú)機(jī)硒螯合后其抗氧化能力強(qiáng)于同含量的大豆多肽或無(wú)機(jī)硒，但增強(qiáng)效果有限[26]。

圖5 不同含硒物質(zhì)對(duì)OH·清除能力比較Figure 5 The OH radicals scavenging ability of different selenium sources

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定6種含硒物質(zhì)的有機(jī)硒含量發(fā)現(xiàn)，SPI、SPR、CE和SY中的硒主要以有機(jī)硒存在，而IS和SPIS中主要以無(wú)機(jī)硒的形態(tài)存在。對(duì)各含硒物質(zhì)進(jìn)行抗氧化分析，結(jié)果表明各含硒物質(zhì)均具有清除自由基的能力，且其抗氧化能力隨濃度的升高而逐漸增強(qiáng)；在相同硒含量下，富含有機(jī)硒的物質(zhì)比只含有無(wú)機(jī)硒的物質(zhì)抗氧化能力強(qiáng)。在碎米薺含硒物質(zhì)中，SPI的抗氧化活性最強(qiáng)，具有較高的研究和生產(chǎn)價(jià)值。

有機(jī)硒具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗疲勞等生物活性，而碎米薺提取物中有機(jī)硒含量較高，但對(duì)其含硒提取物，特別是硒多肽的功能性研究較少，其抗腫瘤、抗疲勞等生物活性還有待探索。