結腸癌肝轉移裸鼠模型的建立

李華馳，熊治國，謝 敏，談 凱，殷 濤，馮茂輝

(1. 湖北省腫瘤醫院胃腸外科，武漢 430079；2. 武漢大學中南醫院胃腸外科，武漢 430000)

結腸癌血行轉移最常見的靶器官是肝，約50%以上的患者最終會出現肝轉移[1]。目前根治性手術切除是唯一能根治結腸癌的方法，但手術切除后仍有20%～50%患者出現肝轉移，5年生生存率低于10%[2]。因此結腸癌肝轉移是影響患者預后的最主要因素。研究和建立結腸癌肝轉移的動物模型，對于結腸癌肝轉移的防治具有重要意義。目前裸鼠造模方法主要有脾注射法、門靜脈注射法、盲腸原位種植、肝注射等[3]。他們的優缺點及適用范圍仍有爭論。本實驗采用脾注射法模擬結腸癌細胞經血行轉移至肝的途徑和過程，采用保脾法及切牌法兩種方式構建裸鼠肝轉移模型，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

鼠結腸癌細胞CT26購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，人結腸癌細胞HCT116由腫瘤生物學行為湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 實驗動物

SPF級雄性Balb/c 裸鼠15只，體重20～24 g, 6～8周齡，SPF級雄性Balb/c 小鼠5只,體重20～24 g，6～8周齡，均購自武漢大學動物實驗中心[SCXK(鄂)2016-0016]，均放置于武漢大學A3實驗室飼養并于武漢大學動物試驗中心進行實驗[SYXK(鄂) 2018-0004]。根據生物安全及生物倫理指導原則，實驗動物飼養和實驗過程中均按實驗動物3R原則給予人道的關懷。本研究實驗動物福利倫理委員會的批準號：201801006。

1.2 主要試劑與儀器

1640培養基(Hyclone公司)、MEM培養基(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、青-鏈霉素雙抗(Beyotime公司)、PBS緩沖液(Gibco公司)。YN-02R1型全自動染色機(深圳市永年科技有限公司)、YN-02B1型組織包埋機(深圳市永年科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

HCT116、CT26細胞使用含10% FBS的1640培養基于37℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養傳代，取對數生長期的癌細胞制成單細胞懸液，臺盼藍染色測定細胞活力>95%，調整細胞濃度為2.5×107/mL。

1.3.2 實驗分組

分為4組:將15只Balb/c裸鼠分為3組，每組5只，另外5只Balb/c小鼠單獨成組。A組：將HCT116細胞注射入Balb/c裸鼠脾并保留脾建模；B組：將HCT116細胞注射入Balb/c裸鼠脾并切除脾建模；C組：將CT26細胞注射入Balb/c裸鼠脾并保留脾建模；D組：將HCT116細胞注射入Balb/c小鼠脾并保留脾建模。

1.3.3 裸鼠肝轉移建模方法

(1)保脾法：小鼠稱重后麻醉，麻醉成功后，用膠帶固定小鼠四肢于手術臺上，使用碘酒皮膚消毒，鋪無菌孔巾，于左側腋后線肋緣下行縱行切口，長約0.5～1 cm，剪開腹膜,進腹后于左腹腔外側找到脾，牽出腹腔外，用1 mL注射器從脾下極貼近脾包膜向上進針，將測定細胞濃度為2.5×107/mL的HCT116、CT26細胞懸液0.2 mL緩慢注射于脾內，約3～5 min，見注射部位變紅、腫脹后拔針，立即用酒精棉球按壓針眼直至無活動性出血，依次間斷縫合腹膜、皮膚，關腹。

(2)切脾法：麻醉、消毒及入腹步驟同保脾法，進腹后于左腹腔外側找到脾，牽出腹腔外，用1 mL注射器從脾下極貼近脾包膜向上進針，將測定細胞濃度為2.5×107/mL的HCT116細胞懸液0.2 mL緩慢注射于脾內，約3～5 min，見注射部位變紅、腫脹后拔針，輕揉脾，擠壓癌細胞經脾靜脈進入肝，5～10 min后結扎脾血管并切除脾，依次間斷縫合腹膜、皮膚，關腹。

1.3.4 觀察指標

術后將四組小鼠置入溫箱中保暖，腹腔注射0.1 mL濃度為1%的哌拉西林，蘇醒后給予葡萄糖鹽水飼養，繼續在SPF3級實驗室IVC內獨立飼養。待小鼠自然死亡后觀察肝表面轉移癌結節數目、大小、位置， 雙肺、腹腔受累情況，有無腹腔淋巴結轉移及腹水。切除整個肝，稱重后切除轉移灶組織，用10%福爾馬林固定后石蠟包埋，連續組織切片，行HE染色，常規病理學檢查，以明確肝轉移情況。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況對比

手術后各組動物一般情況對比見表1。

表1 模型小鼠一般情況對比

2.2 生存時間

對各組的平均生存時間進行方差分析，統計數據進行方差分析，F=26.36。A組生存時間平均為(26.6±3.4) d；B組(P<0.05)生存時間顯著高于A組平均為(36.8±4.2) d；C組(P<0.05)顯著低于B組，與A組無顯著性差異(P>0.05)生存時間平均為(20.2±2.6) d；D組顯著高于其他三組(P<0.05)，平均生存時間為(45.6±2.8) d。見圖1。

注：*P<0.05。圖1 各組鼠的平均生存時間Note. *P<0.05.Figure 1 Mean survival time of the mice in each group

2.3 肝轉移率及肝轉移灶情況

統計數據進行方差分析，F=15.39。A組：肝轉移率為100%；結節數目為(4.6±0.4)個/每只，尺寸為(0.12±0.08) cm3；B組：肝轉移率為40%，顯著低于A組(P<0.05)，結節數目為(8.3±0.6)個/每只，顯著高于A組(P<0.05)，尺寸(0.08±0.05) cm3無顯著差異；C組：肝轉移率為100%顯著高于B組(P<0.05)，尺寸為(2.25±0.4) cm3，顯著高于A組和B組(P<0.05)，結節數目為(12.6±2.3)個/每只，顯著高于A組和B組(P<0.05)；D組未見肝癌轉移。見圖2。

2.4 脾原位腫瘤及其他部位轉移情況

統計數據進行方差分析，F=12.36。A組脾注射部位均成瘤，大小約(1.11±0.3) cm3；C組脾注射部位均成瘤，大小約(1.4±0.3) cm3顯著高于A組(P<0.05)。D組小鼠脾無瘤體形成。A組腹腔轉移率100%；B組腹腔轉移率40%；C組腹腔轉移率100%，A組和C組均顯著高于B組(P<0.05)。心、肺、腦、腎均未見轉移灶。見圖3。

2.5 病理學檢查

A組高倍鏡下可見大量成片癌細胞聚集成團，成巢狀，細胞核體積大，深染，核分裂相多見，胞漿少。B組高倍鏡下癌細胞聚集成團，并形成癌結節，細胞異型性明顯，細胞核深染，可見核分裂像。C組在高倍鏡下可見成片腫瘤細胞聚集，伴明顯壞死，癌細胞核深染，分化差，有明顯的異形性，部分可見核分裂象。D組無肉眼可見轉移及種植，組織病理學檢查也未發現轉移灶。見圖4。

3 討論

腫瘤的侵襲轉移是非隨機性的，具有明顯器官特異性，如乳腺癌遠處轉移靶器官多為肺、骨、肝，前列腺癌的骨轉移，結腸癌最常見的侵襲轉移靶器官為肝、肺[4]。侵襲轉移是腫瘤患者最主要的死亡原因。因此建立一種操作簡便、穩定性高、模擬性好的結腸癌肝轉移模型，對研究結腸癌肝轉移的發生機制具有十分重要的意義。

注：a：肝轉移率；b：肝結節數；c：結節平均尺寸。*P<0.05。圖2 肝轉移率及肝轉移灶情況Note. a, Liver metastasis rate. b, Number of liver cancer nodules. c, Mean size of liver cancer nodules.* P<0.05.Figure 2 Liver metastasis rate and liver metastases

注：a：腹腔轉移率；b：腫瘤平均尺寸。*P<0.05。圖3 脾原位腫瘤及其他部位轉移情況Note. a, Peritoneal metastasis rate. b, Mean tumor size.*P< 0.05.Figure 3 The splenic orthotopic tumors and other metastatic sites

注：A～D：分別為A、B、C、D組病理切片。圖4 裸鼠肝病理組織切片(HE染色，× 10)Note. A-D, Pathological sections from Groups A, B, C and D, repectively.Figure 4 Histopathological changes in the mouse liver tissues. HE staining

目前裸鼠造模方法主要有脾注射法、門靜脈注射法、盲腸原位種植、肝注射等，各有優缺點。門靜脈注射法肝轉移率高達80%～100%，但其操作困難，且易發生門靜脈癌栓，導致癌栓外溢造成腹腔內播散性轉移，死亡率高。肝注射法操作簡單，肝成瘤率高，但周圍極少發現轉移的瘤體結節，不能模擬結腸癌肝轉移的生物學特性[5]。盲腸原位種植被認為最能模擬結腸癌侵襲轉移的造模方法，但肝轉移成瘤率低，在發生肝轉移前因原位種植部位瘤體生長過快，瘤體過大造成腸梗阻而導致小鼠過早死亡[6]。1984年Kozlowski提出癌細胞脾注射法是研究結腸癌肝轉移的最佳模式[7]。脾注射癌細胞建模模擬了結腸癌術后肝血行轉移肝的過程，造模成功率較高。原因是將足夠數量的結腸癌細胞注射到脾內,利用脾血流豐富的特點,通過門靜脈進入肝后即可形成轉移灶。Kozlowski利用放射性核素標記腫瘤細胞并追蹤癌細胞的分布，結果顯示注射后30 min內有77%的癌細胞寄居于肝，且注射后24 h仍有27%的癌細胞保留在肝，說明通過脾注射能使大部分癌細胞進入肝，從而保證肝成瘤率。

脾注射肝轉移模型分為保脾法和切脾法。不同點在于切脾法避免脾種植部位成瘤，能較好的模擬結腸癌腫瘤轉移的生物學行為，成瘤率高，避免了對實驗結果和小鼠生存期的影響[8]。保脾法建模保留了脾，保存了小鼠固有的抗腫瘤免疫功能。血液中的癌細胞必須逃逸機體免疫細胞及活化的細胞因子的殺傷后才能存活下來，故能轉移至肝的癌細胞是經過機體篩選的具有高轉移傾向的惡性腫瘤細胞，所以保脾法更能反映瘤細胞的惡性程度，更符合臨床轉移癌的特性[9]。國內有學者比較了保脾法和切脾法兩種方法造模，實驗結果表明切脾法比保脾法成瘤率更高[10-11]。值得注意的是，近期Wang等人[12]采用保脾法應用SW620-luc細胞系成功建立了結腸癌肝轉移，并指出銀杏葉提取物可進一步促進成瘤率。然而，Wang等人實驗并未進行切脾法與保脾法的比較。在本實驗中，切脾組(B組)造模成功率僅為40%，A組、C組采用保脾法造模，成功率均為100%，肝表面及切面肉眼均可見瘤結節。本實驗結果與宋大遷等實驗結果想反，分析其原因可能是實際操作時脾注射完成后通常需要按壓止血3～5 min，但按壓脾很容易造成脾注射點再次出血，癌細胞易隨著血液從注射點流出，導致進入血液中的癌細胞數量減少，使造模成功率降低。本實驗中，對比生存期及成瘤情況，A組肝轉移瘤右葉多于左葉，平均(4.6±0.4)個/只，生存時間平均為(26.6±3.4)d；B組肝轉移瘤較分散，平均(8.3±0.6)/只，顯著高于A組(P<0.05)；生存時間平均為(36.8±4.2)d，顯著高于A組(P<0.05)。這與宋大遷等實驗結果一致，切脾組腫瘤分布更分散，帶瘤生存期更長。保脾法生存期較切脾組短，原因在于小鼠常較早地死于脾內腫瘤。但是模型的成功率顯著低于保脾法(P<0.05)。

另外在建立結腸癌肝轉移動物模型的過程中，選擇高轉移潛能的癌細胞株也是關鍵，最常使用的結腸癌細胞包括CT26、HCT116、LOVO、HT29等。Goodwin等人[13]也已報道通過盲腸壁接種CT26細胞系最終成功建立結腸癌肝轉移。本實驗選用人結腸癌HCT116細胞及鼠CT26結腸癌細胞造模[14-16]。對比A組、C組，兩組裸鼠均可以快速成瘤，造模成功率高達100%。C組裸鼠肝轉移數目明顯多于A組裸鼠(P<0.05)，轉移瘤體積更大(P<0.05)，肝右葉被巨大轉移灶占據；A組裸鼠肝腫瘤較為分散，體積較小。分析其原因，可能因為CT26結腸癌細胞由于其種屬特異性，在小鼠體內更容易逃逸免疫細胞的攻擊而存活下來，造模成功率較高[17-23]。

在實驗過程中，如果操作不當容易造成癌細胞液外溢從而形成腹腔內廣泛轉移。結合B組成瘤率低，因此，我們總結經驗如下：①手術切口取左側腋后線肋緣下縱行切口，創傷小，易顯露，不易損傷脾；②注射時禁穿破脾，應從脾下級沿脾長軸水平進針，深度保持在0.5 cm左右為宜；③保證注射的細胞數量足夠，達到2.5×107/mL，因為進入血液中的癌細胞必須逃逸機體免疫細胞及活化的細胞因子的殺傷后才能存活下來，從而在肝形成轉移灶。④注射時間應在3～5 min，不易過快，避免脾被膜張力過大而破裂；⑤注射完畢后續待脾顏色轉紅后再拔針，并迅速按壓針眼，避免因脾壓力過大造成瘤細胞外溢。

綜上所述,本實驗通過比較不同種屬的結腸癌細胞造模和不同種類小鼠造模的成功率及優缺點，以及比較脾注射保脾法和切脾法的成功率及優缺點，發現使用裸鼠、采用保脾法能獲得較高的造模成功率，能有效模擬人類結腸癌細胞經血行轉移至肝的途徑和過程。