陜西市售嬰幼兒食品中阪崎克羅諾桿菌流行狀況及相關特性研究

張 強，羅勤貴，趙南昕，齊雨薇，張 倩，葛武鵬，楊保偉

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)是一種常見的食源性致病菌，可導致新生兒和免疫力低下人群菌血癥、腦膜炎和壞死性小腸結腸炎等疾病，并可引起嚴重的神經系統后遺癥、甚至死亡，致死率高達40%～60%[1-2]。此外，一些腫瘤、糖尿病患者及老年人等感染該菌還可引起膿毒血癥，泌尿道、呼吸道、創傷面或局部感染。國際食品微生物標準化委員會已將阪崎克羅諾桿菌列為嬰兒配方奶粉的A類致病菌[3]。

目前，雖對阪崎克羅諾桿菌的環境來源尚不清楚，但許多病例報告均表明嬰兒配方粉是該菌的主要感染載體，2004年，安徽阜陽劣質嬰兒配方粉事件中患者所表現的頭部腫大和反應遲鈍等臨床癥狀與阪崎腸桿菌感染極為相似，研究結果也證明了該菌和感染間的相關性[4]。同時，研究者也已從乳粉原料[5]、谷物[6]、巧克力[6]、馬鈴薯粉[6]、嬰兒干制食品和配方食品[1,4,7]、意大利面食加工廠和家庭環境中分離出阪崎克羅諾桿菌[7-9]。相對而言，國外對阪崎克羅諾桿菌污染嬰幼兒配方乳粉，進而導致嬰幼兒感染該菌引起疾病爆發的事件較多，而中國關于市售嬰幼兒配方食品中該菌的流行狀況及引起疾病爆發的問題卻鮮見報道。

本研究調查從陜西省部分超市和婦幼用品專賣店采集的366份嬰幼兒配方乳粉、米粉及其他食品中阪崎克羅諾桿菌的流行狀況，并對分離株進行藥敏性、基因分型和毒力因子檢測研究，旨在掌握市售嬰幼兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌的污染狀況及相關特性，為預警與控制該菌流行及風險監測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

嬰幼兒配方乳粉、米粉和其他食品共366份，分別采集自陜西省西安市、寶雞市、咸陽市、武功縣、周至縣、乾縣、禮泉縣、扶風縣、岐山縣和眉縣部分超市及孕嬰專賣店。其中，嬰幼兒米粉220份，嬰幼兒奶粉131份，其他品種嬰幼兒食品15份。采集的樣品基本涵蓋了目前市售的國產和進口嬰幼兒食品品牌。

阪崎克羅諾桿菌標準株ATCC29544和ATCC BAA-894由河南省疾病預防控制中心提供，藥敏性檢測標準質控菌大腸埃希氏菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212為中國藥品生物制品檢定研究院提供。

Lutia-Bertani(LB)營養瓊脂、Mueller Hinton(MH)瓊脂、緩沖蛋白胨水(BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(mLST-Vm)購自北京陸橋技術股份有限公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000均購自Takara寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌分離鑒定 按照國標規定的方法分離檢測阪崎腸桿菌[10],采用阪崎腸桿菌特異性引物ompA-F和ompA-R擴增其ompA基因、測序后對菌株進行確定(表1)，檢測中以ATCC29544作為陽性對照。獲得阪崎腸桿菌后，再使用Stoop等[11]建立的方法從阪崎腸桿菌中鑒定出阪崎克羅諾桿菌。

1.2.2 藥敏性測定 供試抗生素分別為：利福平(RIF)、氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMO)、鏈霉素(STR)、頭孢西丁(FOX)、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(TMP/SMZ)、四環素(TET)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、氯霉素(CHL)、萘啶酮酸(NAL)、慶大霉素(GEN)、環丙沙星(CIP)、頭孢曲松(CRO)、加替沙星(GAT)、頭孢哌酮(CEFO)和左氧氟沙星(LEV)。藥敏性測定按照美國臨床實驗室標準化委員會(the Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI)推薦的瓊脂稀釋法進行，按照CLSI的規范進行藥敏性結果判讀[12]。

1.2.3 毒力基因檢測 采用煮沸法制備PCR模板。毒力基因檢測用引物序列等信息詳見表1，由北京奧科生物技術有限公司合成。檢測中以ATCC29544和ATCC BAA-894為陽性對照。

PCR反應體系為25 μL。各PCR反應物的濃度及相應添加量分別為：MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、引物(50 pmol/L)各0.3 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、模板5 μL，加超純水至25 μL。擴增條件為94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸7 min；最后4 ℃條件下保溫。退火溫度由擴增目標基因引物組成確定(表1)。

使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。取2 μL PCR產物與適量Loading Buffer混勻，加入瓊脂糖凝膠點樣孔，以DNA Marker DL2000為對照，100 V恒壓電泳30 min。電泳結束后將凝膠移入凝膠成像系統照像分析。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳(Pulse Field Gel Electrophoresis,PFGE)分型 PFGE基因分型方法主要按照美國疾病預防控制中心(the Center for Disease Control and Prevention,CDC)推薦的應用于食源性疾病監測網PulseNet中適用于大腸桿菌和沙門氏菌的標準方法進行[13]。

表1 PCR引物及其他參數Table 1 PCR primers and other parameters

注:F表示上游引物，R表示下游引物。

Note:F represents forward primer,R represents reverse primer.

2 結果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌分離與檢測

366份樣品中共檢出87份阪崎克羅諾桿菌陽性樣品，169株阪崎克羅諾桿菌。檢出菌株ompA基因PCR檢測結果如圖1所示。

2.2 阪崎克羅諾桿菌的流行狀況

阪崎克羅諾桿菌陽性樣品平均檢出率為23.8%。131份嬰幼兒配方乳粉中檢出陽性樣品24份，檢出率為18.3%。配方乳粉陽性樣品全部為牛乳粉，配方羊乳粉中未檢出該菌。220份嬰幼兒米粉中檢出陽性樣品60份，檢出率為27.3%。15份其他嬰幼兒食品中檢出陽性樣品3份，檢出率為20.0%(表2)。

M.DL2000 bp DNA marker，1.ATCC29544(陽性對照) ATCC29544 (positive control);2.陰性對照 Negative control; 3～5.待檢菌株 Strain identified

圖1 阪崎克羅諾桿菌ompA基因
PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳
Fig.1 Agarose based electrophoresis of PCR detection ofompAofCronobactersakazakii

表2 嬰幼兒食品中阪崎克羅諾桿菌檢出狀況Table 2 Prevalence of Cronobacter sakazakii in infant and baby foods

2.3 阪崎克羅諾桿菌的藥敏性

168株(99.4%)阪崎克羅諾桿菌對利福平產生抗性，對其他供試抗生素具有抗性的菌株及相應比例依次為阿莫西林20.12%、鏈霉素18.93%、四環素17.16%、氨芐西林12.43%、慶大霉素11.24%、頭孢西丁5.92%、甲氧芐啶/磺胺噁唑5.32%、阿莫西林/克拉維酸4.74%、氯霉素2.96%、加替沙星1.78%、環丙沙星 1.78%、萘啶酮酸1.78%；頭孢曲松的菌株最少 (0.59%)。未檢測到對左氧氟沙星和頭孢哌酮耐藥的菌株(表3)。

17株(10.06%)菌對四環素表現出中介耐藥，對其他供試抗生素中介耐藥的狀況依次為氨芐西林5.92%，頭孢哌酮5.33%，氯霉素和頭孢西丁2.96%，鏈霉素、環丙沙星和萘啶酮酸2.37%，左氧氟沙星、阿莫西林和阿莫西林/克拉維酸1.18%，利福平0.59%(表3)。

169株阪崎克羅諾桿菌中，48株(28.40%)分離自嬰幼兒配方乳粉。該48株菌全部對利福平耐藥，對氨芐西林和阿莫西林耐藥的菌株比例均為35.42%，對鏈霉素和頭孢西丁的耐藥菌株比例均為14.58%，對甲氧芐啶/磺胺噁唑為12.50%。未檢出乳粉源分離株對加替沙星、左氧氟沙星和頭孢哌酮耐藥(表4)。

表3 阪崎克羅諾桿菌的藥敏性(n=169)Table 3 Antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii

注：鏈霉素的耐藥折點參考美國國家抗生素監測網耐藥折點值[14]。

Note:The breakpoint for streptomycin referenced to that of the National Antimicrobial Resistance Monitoring System of the United States of America[14].

169株阪崎克羅諾桿菌中，121株(71.60%)源于嬰幼兒米粉和其他食品。其中120 (99.17%)株對利福平產生抗性，對氨芐西林和阿莫西林耐藥的米粉源菌株比例均為20.66%，對鏈霉素為14.05%、頭孢西丁為13.22%。未檢出米粉和其他食品源菌株對加替沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松和頭孢哌酮耐藥(表 4)。

2.4 阪崎克羅諾桿菌的多重耐藥性

169株阪崎克羅諾桿菌至少可抗1種抗生素，有15株菌(8.88%)至少可抗4種抗生素，4株(2.37%)至少可抗7種抗生素，未檢出可抗10種以上抗生素的菌株。12株(63.16%)源于配方乳粉的菌株和7株(36.84%)源于米粉的菌株可抗至少4種抗生素(表5)。

2.5 阪崎克羅諾桿菌毒力基因檢測

ompX檢出率最高(79.88%)，其次分別為cpa(71.01%)、sip(65.68%)和hly(55.03%)。分離菌株中檢測到任何目標基因(表6)。分離株中同時檢出3種目標毒力基因的情況最為普遍(32.54%)，同時檢出4種毒力基因的菌株比例為28.99%，檢出2種毒力基因的菌株比例為 19.53%，檢出1種毒力基因的菌株比例最低 (11.83%)(表7)。

2.6 阪崎克羅諾桿菌PFGE分型

對阪崎克羅諾桿菌進行XbaⅠ酶切、PFGE電泳、BioNumerics軟件聚類分析后，按照95%及以上同源性，169株阪崎克羅諾桿菌的可被分為4個大簇、8個小簇和1個單一的基因型(圖2)。

分離自同一種類嬰幼兒食品中的菌株經PFGE分型聚類后基本處于同一大簇。T2、T3、T4、T5、T6、T7、T12和T13等8簇中的菌株均分離自米粉，T9和T10簇中的菌株均分離于配方乳粉，表明源于同一種類的嬰幼兒食品中的菌株之間親緣關系較近。

除了品牌H1和N1源阪崎克羅諾桿菌分離株的基因圖譜較為分散外，其他7個主要品牌嬰幼兒食品中的菌株的基因圖譜分布均比較集中，基本位于同一小簇或同一簇。如：分離自品牌Y1、M1和F1的菌株主要分布在T3簇，分離自品牌Y2的菌株主要分布在T2簇，分離自品牌W1的菌株主要分布在T1簇和T3簇，分離自品牌B1的菌株主要分布在T3簇和T9簇，表明分離于同一品牌嬰幼兒食品的菌株具有較高的基因同源性。

表4 阪崎克羅諾桿菌分離株的藥敏性Table 4 Antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii isolates

表5 不同食品源阪崎克羅諾桿菌的多重耐藥性Table 5 Multidrug resistance of Cronobacter sakazakii in different foods

表6 阪崎克羅諾桿菌毒力基因檢測結果(n=169)Table 6 Results of virulence genes detection in Cronobacter sakazakii

注：cpa為血漿纖溶酶原激活物編碼基因，hly為溶血素編碼基因，ompX為外膜蛋白編碼基因，sip為免疫相關蛋白編碼基因。

Note:cpais plasminogen activator gene;hlyis hemolysin gene;ompXis outer membrane gene X;sipsiderophore-interacting gene.

表7 阪崎克羅諾桿菌中同時檢出多種毒力基因結果(n=169)Table 7 Results of multi-virulence genes detection in Cronobacter sakazakii (n=169)

3 討 論

阪崎克羅諾桿菌在食品和環境中分布廣泛，具有較強的增殖力、耐熱性和耐高滲透壓能力，易在食品加工過程形成生物膜[15]。嬰幼兒配方粉中極微量的污染(< 3 cfu/100g)就可能大量繁殖，進而導致感染事件的發生[3,16]。2004年10月，Farber[17]在第一屆國際食品微生物標準委員會(International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)中國國際食品安全會議上指出，不同地區阪崎克羅諾桿菌的檢出率(0.12%～14.2%)存在明顯的不同。

(圖續轉下頁 Be continued in next page)

T1～T13表示PFGE分型后不同的亞型 T1 to T13 stand for different subtypes after PFGE subtyping

自阪崎腸桿菌發現至今，人們對其致病性已有廣泛一致的認識，但對其致病機理、流行病學及病原學特性研究尚淺。一些研究顯示，即使嬰幼兒配方食品的各項指標符合相關國家標準，也有可能被阪崎腸桿菌污染。本次調查結果表明所采集的嬰幼兒配方食品均有不同程度的阪崎克羅諾桿菌污染，且檢出率較高。由于該菌致病性較強，且主要危害嬰幼兒健康，因此國家應制定比較詳細且較為嚴格的檢測指標，開發較為快速的檢測方法，縮短檢測時間，保障嬰幼兒食品安全[18]。

研究中嬰幼兒配方食品源阪崎克羅諾桿菌分離株的耐藥性明顯低于徐英春等[19]對臨床分離株的研究結果，原因可能是由于該研究中的分離株來自于食品，而臨床分離株可能受臨床用藥的影響較大，產生了較強的耐藥性。研究表明，阪崎克羅諾桿菌對β-內酰胺類抗生素、特別是頭孢菌素較為敏感，但其對三代頭孢(頭孢曲松)和四代頭孢(頭孢西丁)的抗性較裴曉燕等[20]在2007年從嬰幼兒奶粉中分離的阪崎腸桿菌的有所提高，表明隨著抗生素的廣泛使用，存在于嬰幼兒食品和環境中的阪崎克羅諾桿菌在長期的進化過程中耐藥水平也在逐漸提高。

與其他腸桿菌科革蘭氏陰性細菌相比，阪崎克羅諾桿菌的耐藥程度總體上較低，這可能與該菌主要屬于環境菌而非嗜性寄宿腸道內環境微生物，相比之下發病率較低、治療性用藥較少和該細菌的生物特點等因素有關。但是，阪崎腸桿菌感染嬰幼兒后的死亡率可高達50%以上，除兒童的免疫狀況外，合理選擇和有效應用抗生素，對提高治愈率、降低死亡率是非常重要的措施。研究嬰幼兒食品源阪崎克羅諾桿菌的藥敏性對控制該菌耐藥水平的提高和保障食品安全具有重大意義。

PFGE結果表明，源于同類食品或同一品牌不同批次食品的菌株具有較高的基因同源性，這與裴曉燕等[1]前期對中國市售嬰幼兒配方粉源阪崎腸桿菌的基因型研究結果相同。究其原因，很可能是用于生產同類嬰幼兒食品時所用的原輔材料(如：淀粉、各種維生素和DHA等)由同一供應商提供，生產環境部分相同或比較相似，從而導致阪崎克羅諾桿菌在生產源頭或生產過程對原輔料造成污染，進而在不同品牌的同類食品中檢出，分離株在親緣關系上較為接近。

另外，由于研究中采集的同一品牌的食品樣品并非同一批次生產，這就說明該品牌的嬰幼兒食品在生產過程可能存在某一環節的不安全問題，導致該品牌不同批次的嬰幼兒食品均存在被同一基因型的阪崎克羅諾桿菌污染的可能。食用該品牌嬰幼兒奶粉或米粉的嬰幼兒如果受到阪崎克羅諾桿菌的侵染而患病，可能會出現相同或相似的癥狀，或出現集中爆發的趨勢。

PFGE聚類結果表明除了幾個小簇由于所涵蓋的菌株數量較少而無法顯示出具有相同或相似基因型菌株的食品品牌多樣性特征外，其他各大簇中所包含的阪崎克羅諾桿菌陽性食品品牌種類都不少于8種，表明分離于這些品牌的嬰幼兒食品的菌株在不同地域之間的流行比較廣泛，在自然界進化過程中可能有著較近的同源關系，或這些不同品牌的嬰幼兒食品在生產過程使用了被同一克隆的阪崎克羅諾桿菌污染的同一基料或輔料。例如，T3簇中的14-20(1)為品牌H2的嬰幼兒奶粉，但酶切圖譜顯示它與從品牌為Y2的嬰幼兒米粉中分離的14-10(1)之間同源性高達 99.5%以上。在不同品牌的嬰幼兒食品中檢出具有相同或相似基因型的阪崎克羅諾桿菌表明該菌具有在大范圍導致嬰幼兒疾病爆發的可能性，應引起相關食品安全檢測部門的高度重視。