紫果西番蓮愈傷組織誘導分化及不定芽增殖研究

王亞楠 張湛儀 趙李姍 余俊玲 汪夢婷 蔡年輝 唐軍榮 許玉蘭

( 1. 西南林業大學國家林業局西南地區生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 西南林業大學西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650233；3. 西南林業大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650233；4. 奈曼旗林業局奈曼旗沙日浩來林業工作站，內蒙古 通遼 028300)

西番蓮（Passiflora caerulea）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）的一種熱帶草質或半木質藤本植物，又名雞蛋果、百香果、計時果[1]。西番蓮屬植物有400多種，原產南美洲的巴西至阿根廷一帶[2]。我國主要分布在臺灣、廣東、福建、廣西、浙江、四川等省區。果實供食用的西番蓮主要有6種：紫果西番蓮（P. edulis）、黃果西番蓮（P. edulisf.flavicarpa.）、樟葉西番蓮（P. laurifolia）、大果西番蓮（P. quadrangularis）、甜果西番蓮（P.1igularis）和香蕉西番蓮（P. mollissima），目前商業栽培種主要是紫果西番蓮和黃果西番蓮[3]。

西番蓮果實為漿果，味道鮮美，富含各種營養成分，在國際飲料市場占有重要地位，素有“飲料之王”的美譽，且根、莖、葉、花還可入藥[3]。近年來國際市場對西番蓮果汁的需求每年以15%～20%的速度增長，大有供不應求之勢。除果汁外，果汁粉、蜜餞、口香糖等產品也深受歡迎[4]。而我國西番蓮種質資源相對缺乏，生產中存在較多問題，如品種單一，產量低，品質、抗病性差，影響了西番蓮種植業和加工業的發展[5]。紫果西番蓮果汁味道芬芳，其獨特的芳香味是由60多種揮發性化合物組成，有脂類、醇類、醛類、酮類、萜烯類和其他雜類化合物[6]。但在紫果西番蓮的果實中，果汁（漿）占果質量的45%～53%，種子占果質量的5%～20%[6]。果實中大量的種子，會影響食用的口感，也會增加果實的加工成本。因此，在今后西番蓮的品種選育中，果實中少籽或無籽也是品種選育的一個重要目標。

基于植物組織培養開展的倍性育種，是人工獲得三倍體的最有效途徑，但該項工作的首要關鍵，就是要有一個穩定高效的植株再生體系。目前關于西番蓮的組培研究中，牛俊樂等[7]、李紅艷等[8]均利用西番蓮的幼嫩帶腋芽莖段誘導出了芽；豐鋒等[9]利用西番蓮的子房、柱頭、幼胚誘導出愈傷組織，但是通過種子離體培養得到子葉來建立西番蓮離體快繁體系的僅有史沉魚等[10]，且愈傷組織誘導率及芽增殖率均較低，植株再生體系的再生率不高。Sanchez等[11]對西番蓮屬植物的葉綠體DNA進行限制性內切酶片段長度多態性分析（RFLP），結果顯示，西番蓮種間存在廣泛的遺傳變異，但是基于離體快繁技術培育篩選優良品種，并通過酶分解得到原生質體，繼續培養得到再生植株，為西番蓮遠緣雜交，克服有性雜交不親和性提供手段，從而使引進優良西番蓮的抗性基因成為可能[2]。基于此，為了建立高效的紫果西番蓮的植株再生體系，以紫果西番蓮種子離體培養的子葉為實驗材料，研究西番蓮的植株再生體系，為西番蓮優良家系的快速繁殖、倍性育種、基因工程以及遺傳轉化方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 無菌材料獲得

將紫果西番蓮的種子經80%濃硫酸浸泡3.5 h使其碳化部分種皮，然后在無菌操作臺分別用75%的乙醇消毒30 s和0.1%的升汞進行消毒8 min，消毒結束后，無菌水沖洗3～4次，最后去除剩余種皮，將完整的種子接種在培養基上，30 d后取其展開的子葉作為后續實驗材料。

1.2 愈傷組織誘導

將葉片切成1.5 cm×1.5 cm左右的大小方塊，在垂直葉脈處輕輕劃出傷口，然后接種到愈傷組織誘導培養基上。選擇MS為基本培養基，分別附加瓊脂3.8 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.9±0.1，添加不同濃度的細胞分裂素TDZ（噻苯隆）（0.5、2.0 mg/L），生長素2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），經 121 ℃ 高溫滅菌20 min，共8個處理，每個處理3次重復，每個重復5瓶，每瓶接入2個材料。

1.3 不定芽誘導

將誘導出的愈傷組織，轉移至不定芽分化培養基中。以MS為基本培養基，分別附加瓊脂3.8 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.9±0.1，經121 ℃高溫滅菌20 min，添加不同濃度的細胞分裂素TDZ（1.0、1.5、2.0 mg/L），生長素2,4-D為0.5 mg/L，共4個處理，每個處理3次重復，每個重復5瓶，每瓶接入2個材料。

1.4 不定芽增殖

以MS為基本培養基，分別附加瓊脂4.0 g/L，蔗糖 30 g/L，pH為5.9±0.1，經 121 ℃ 高溫滅菌20 min，添加不同濃度的細胞分裂素6-BA（6-芐氨基嘌呤）（1.0、2.0、3.0 mg/L），生長素IAA（吲哚-3-乙酸）（0.1、0.3、0.5 mg/L）。采用L9(34)正交設計實驗（表1、表2），共9個處理，每個處理3次重復，每個重復5瓶，每瓶接入2個材料。

1.5 培養條件

培養室的溫度（25±2） ℃，光照時間為12 h/d，光照強度1 000～1 500 lx。

表 1 實驗因素水平Table 1 Factors and levels of the experiment

表 2 6-BA和IAA正交實驗設計Table 2 Orthogonal test design of 6-BA and IAA

1.6 數據分析

用Excel表格對數據進行整理，SPSS 18.0進行數據統計、方差分析、多重比較（Duncan’s法）以及極差分析。

2 結果與分析

2.1 生長素與分裂素不同配比對愈傷組織誘導的影響

在不同2,4-D與TDZ質量濃度配比的各個培養基上，西番蓮愈傷組織誘導呈顯著差異。葉片接進培養基7 d后傷口處開始膨大，10 d開始有淡綠色愈傷組織點出現，30 d后統計結果（表3）。由結果可以看出，處理2的誘導率與處理1、5、6、8之間存在顯著差異，愈傷組織誘導率最高的是處理2，為73.33%，愈傷組織為黃綠色，較緊實，量比較多，并有不定芽的分化，誘導率最低的為處理5，未見有愈傷組織，且在30 d統計的時候，葉片出現褐化死亡。在TDZ濃度為0.5 mg/L時，隨著2,4-D濃度的增高，愈傷組織誘導率也增加，在2,4-D為1.0 mg/L時達到最大值，隨后出現下降趨勢。當TDZ濃度提高到2.0 mg/L時，誘導率也是先上升后下降。由結果還可以看出，當TDZ濃度從0.5 mg/L提高到2.0 mg/L時，誘導率整體出現下降的趨勢，說明高濃度TDZ可能會抑制愈傷組織的形成，并且形成的愈傷組織均為黃色偏白色，繼續培養分化能力很弱。綜合比較，誘導西番蓮子葉愈傷組織的最適培養基為：MS+2,4-D 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L。

表 3 不同植物生長調節劑組合對愈傷組織誘導的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on callus induction

2.2 生長素與分裂素不同配比對愈傷組織分化芽的影響

在誘導愈傷組織的過程中，發現當2,4-D的濃度在0.5 mg/L時分化出不定芽，所以在誘導愈傷組織分化芽時將2,4-D濃度設置在0.5 mg/L，將TDZ的濃度分別設置在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。愈傷組織接進培養基15 d左右開始有不定芽分化出來，40 d統計結果如表4。由表4可知，4個處理之間的分化率差異不顯著。當TDZ濃度為2.0 mg/L時，不定芽誘導率最高，為46.67%，且誘導出的叢生芽數量較多，芽較粗壯，適合做誘導繼代材料，誘導率最低的TDZ為1.5 mg/L，為6.67%，不定芽數量較少，但是分化出的不定芽較高，說明提高TDZ的濃度，可能對芽的分化以及生長是比較有利的。綜合來看，誘導愈傷組織分化不定芽的最適培養基為：MS+2,4-D 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L。

圖 1 西番蓮誘導分化Fig. 1 Induced differentiation of P. caerulea

表 4 不同植物生長調節劑組合對愈傷組織分化芽的影響Table 4 Effects of the different hormone combinations on callus differentiation buds

2.3 生長素與分裂素不同配比對不定芽增殖的影響

不同的細胞分裂素可以促進西番蓮不定芽增殖，前期實驗表明以6-BA的增殖效果最好。將生長到基本一致的不定芽切下，接到不同濃度的6-BA與IAA組合的培養基上，各處理可對誘導出的不定芽進行增殖，初期不定芽傷口處膨大長出少量黃綠色愈傷，培養10 d左右在芽的基部開始有少量不定芽點長出，增殖倍數從1.43～2.97（表5），平均的啟動時間集中在10～15 d，45 d后統計芽的增殖數量。結果表明，不同處理對不定芽增殖率影響達到了顯著水平，用Duncan法對每個處理進行多重比較，處理2的增殖率顯著高于除了處理5、7的其他處理。處理2的增殖倍數最高，為2.97，此時6-BA的濃度為1.0 mg/L，IAA的濃度為0.3 mg/L，苗的長勢較好，比較健壯，葉片展開面積較大，且為嫩綠色。增殖倍數最低的是處理8，為1.43，此時6-BA的濃度為3.0 mg/L，IAA的濃度為0.3 mg/L。由結果還可以看出，當IAA濃度為0.3 mg/L時，隨著6-BA的濃度增大，增殖倍數呈下降趨勢，當6-BA達到3.0 mg/L時，愈傷組織分化不定芽的時間最遲，增殖的不定芽植株較矮，在統計28 d左右逐漸出現基部葉片脫落死亡的現象，而且整個不定芽的葉片均偏黃綠色，不利于繼代使用，說明6-BA濃度過高可能會抑制芽的增殖。

進一步進行極差分析（表6），由表6可知，影響不定芽增殖的主導因子是生長素IAA，理論優水平組合為處理2（A1B2），與實際結果相同，培養45 d后的統計結果顯示，以MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L為最佳增殖培養基，增殖倍數為2.97。隨著6-BA的濃度增大，增殖倍數卻在減小，對因素水平進行方差分析，PA≈0.422＞0.05，表明6-BA濃度的變化對增殖倍數的影響差異不顯著。而隨著IAA濃度的增大，增殖倍數先增大后降低，PB≈0.065＞0.05，表明IAA濃度的變化對增殖倍數的影響差異不顯著。考慮6-BA與IAA交互作用時，隨著2種植物生長調節劑濃度的增大，增殖倍數先增大后降低，但是PA×B=0.084＞0.05，表明2種植物生長調節劑的濃度變化對增殖倍數的影響差異不顯著。

表 5 不同處理組合芽的增殖效果統計學描述Table 5 Descriptive statistics of the proliferation effect of the different combinations of buds

表 6 因素水平的極差分析Table 6 Range analysis of factors and levels

3 結論與討論

在秋水仙素處理愈傷組織進行加倍的過程中，愈傷組織的分化效率會直接影響倍性育種的進程。而在建立穩定高效的植株再生體系中，外植體選擇是至關重要的。本研究以子葉為愈傷組織誘導的初始材料，子葉薄壁組織含量高，是植株再生過程中較為理想的材料。與來自室外母株的成熟莖段上的葉片相比，生理狀態處于幼嫩時期，愈傷組織誘導率較高，且誘導時間較短，再生能力較強[12]。西番蓮種子的外種皮十分堅硬、且種子小，直接挑取子葉十分困難。而經濃硫酸浸泡種皮炭化一部分去種皮再萌發，取無菌苗的子葉作為外植體，可以極大避免污染的發生[10]。

植物生長調節劑能夠有效促進愈傷組織的形成、側芽的萌發和不定芽的產生。TDZ作為一種高效的分裂素，能夠在較短的時間內有效的刺激植株再生[13]。2,4-D是一種人工合成的植物生長素，在低濃度時刺激植物生長，并促進愈傷組織的形成，但在高濃度時，則會抑制生長甚至毒殺植物[14]。愈傷組織誘導結果表明，高濃度的2,4-D和TDZ雖然能刺激植株的愈傷組織生長，但是生長出來的愈傷組織很難繼續分化，不利于芽的誘導以及愈傷組織增殖培養。愈傷組織的誘導受外植體的類型影響較大，而選用合適的外植體，能大大提高愈傷組織的誘導率。史沉魚等[10]利用種子萌發的無菌材料根部誘導愈傷組織最優處理MS+2,4-D 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，誘導率最高僅為32%。包英華等[15]對豇豆（Vigna unguiculata）豐產2號進行愈傷組織誘導時，發現愈傷誘導率下胚軸＞頂芽＞上胚軸＞真葉。而在之后陳高等[16]研究豇豆的子葉和下胚軸的愈傷組織誘導實驗中，證明愈傷組織誘導率子葉＞下胚軸。但是愈傷組織的分化，較愈傷組織的誘導，其難度更高。在研究結果可以看出，經愈傷組織再分化，不定芽的誘導率明顯要低于愈傷組織的誘導率。李紅艷等[17]在研究西番蓮離體培養實驗時對由不同部位誘導出來的愈傷組織進行芽的分化，莖段愈傷組織的不定芽誘導率最高為12.5%，葉柄誘導的愈傷組織，不定芽誘導率為1.39%，而由葉片誘導出的愈傷組織則未能分化。而此次實驗中通過對子葉誘導愈傷組織進行芽的分化，分化率最高為46.67%，最適培養基為：MS+2,4-D 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L，明顯高于前人所做實驗的結果。

繁殖體的增殖，植物生長調節劑是一個非常關鍵的要素。不定芽增殖過程中，隨著6-BA濃度的升高，不定芽增殖倍數整體呈下降趨勢，雖然處理7在6-BA為3.0 mg/L時，增殖倍數達到2.17，但經多次繼代后，會形成較多的畸形芽，導致有效芽的數量呈現下降趨勢；而低濃度的6-BA誘導出的苗會保持較高活力，且畸形苗少。這表明較高濃度的分裂素，雖然可以促進不定芽再生，但不利于繼代增殖。張琴等[4]曾利用子葉誘導出的不定芽進行增殖，增殖系數最高為3.0，最佳培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。陳發興[18]利用西番蓮的莖段誘導出的不定芽進行增殖，增殖系數最高為3.3，最佳培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。本次實驗的增殖倍數最高為2.97，最佳培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L，結果低于二人所得實驗結果，說明不同外植體材料對分化出的不定芽增殖有非常重要的影響[19]。不同種類及配比的生長素與分裂素對不定芽的分化也起到了至關重要的作用[20-22]，分裂素與生長素的配比大時分化率較高，但是過高則會抑制芽的形成，而且對繼代增殖也有不利的影響，這與本次研究結果是相似。

本實驗以紫果西番蓮無菌苗的子葉為外植體開展了植株再生體系的研究，其中愈傷組織誘導率為73.33%，愈傷組織不定芽的誘導率為46.67%，不定芽的繼代增殖倍數為2.97。建立的紫果西番蓮植株再生體系，可滿足后期的多倍體育種需求，也可為工廠化育苗、遺傳轉化提供技術參考。