自噬與腫瘤EGFR抑制劑耐藥的研究進展

楊超波，童 欣，李冠武

（汕頭大學醫學院腫瘤分子生物學開放實驗室，廣東 汕頭 515041）

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一個帶有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白.研究表明它在許多腫瘤中過表達，異常的EGFR 信號通路在腫瘤發生、進展和轉移中發揮著重要作用.EGFR 的抑制劑被廣泛用于治療攜帶EGFR 突變的肺癌患者.目前應用于臨床的EGFR抑制劑包括兩種類型，單克隆抗體和酪氨酸激酶抑制劑，前者通過競爭性結合EGFR 的胞外域來抑制受體的二聚化或促進受體的內化；后者通過競爭性結合ATP 來抑制EGFR 酪氨酸激酶結構域的活性.然而，經過一段時期治療后，絕大多數患者都會產生耐藥.因此，克服耐藥是臨床治療腫瘤的一大重要目標.自噬是細胞處于營養缺乏或應激狀態時的一種自我保護機制.近年來越來越多的研究顯示，自噬在腫瘤EGFR抑制劑耐藥中發揮重要作用.EGFR抑制劑能誘導自噬，而自噬在腫瘤細胞中既可作為保護因素來介導耐藥，又可作為毒性因素來延緩耐藥.因此，調節自噬將為克服腫瘤患者EGFR抑制劑耐藥提供一可行思路.本文對自噬與EGFR抑制劑耐藥的最新研究進展進行綜述.

1 自噬的機制與調節

大自噬（在這篇綜述中指的是自噬）是一個進化上古老和高度保守的新陳代謝過程，它涉及雙層膜囊泡的形成，該囊泡吞噬細胞內蛋白和細胞器并把它們運輸到溶酶體中降解.當細胞遭受各種化學或物理因素作用例如營養缺乏、低氧、活性氧（ROS）積累和DNA破壞等，自噬被誘導以應對外界壓力.自噬的過程可被劃分為這5 個階段：自噬啟動、吞噬泡形成、吞噬泡成熟、自噬體融合和貨物分解，其中，前三個階段需要各種自噬相關基因（ATGs）編碼的蛋白參與.自噬的啟動開始于ULK1（也稱為ATG1）復合物（包含有ULK1、ULK2、ATG13、FIP200 和ATG101），它活化III 型PI3K 復合物，該復合物包含有VPS34（也稱為PIK3C3）、ATG14、UVRAG 和AMBRA1，所有這些均被公認的腫瘤抑制因子Beclin1 所結合，此過程即形成吞噬泡.隨后，吞噬泡內發生各種蛋白的組裝.ATG7 激活ATG12，后者通過ATG10 共價結合于ATG5.ATG5 與ATG16 結合，最終形成出現在吞噬泡膜外表面上的Atg12-Atg5-Atg16 復合物，該復合物有助于吞噬泡的伸長與閉合.ATG4剪切微管相關蛋白輕鏈3（LC3）形成LC3-I，LC3-I 暴露的剪切位點被ATG7 活化并轉移到ATG3.LC3-I-ATG3 復合物共價結合磷脂酰乙醇胺（PE）形成LC3-II，后者整合入自噬泡膜上形成自噬體.最后，自噬體與溶酶體接觸并融合，成為自噬溶酶體，其中的內容物被降解、大分子前體物質被循環利用或用于促進新陳代謝[1].自噬誘導過程與細胞內多條控制細胞增殖或凋亡的分子通路有交互作用.在這些通路中，PI3K/AKT/mTOR 是調節自噬最重要的信號通路，它也是人類腫瘤最常見和最典型的生存機制.此外，作為細胞內能量水平傳感器的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）也是調節自噬的重要信號通路.PI3K/AKT/mTOR 信號通路活化的結果是抑制自噬，而AMPK 信號通路活化的結果是促進自噬.

2 EGFR與腫瘤

位于細胞膜表面的EGFR（HER1 或ErbB-1）是ErbB 家族中的一個受體酪氨酸激酶，該家族還包括HER2（ErbB-2）、HER3（ErbB-3）和HER4（ErbB-4）.在許多不同腫瘤細胞類型中，ErbB 通路通過各種機制被過度活化，包括配體的過表達，受體的過表達或受體的組成性活化.在正常情況下，EGFR 信號由配體結合于受體胞外域而產生.這啟動受體同源/異源二聚化和胞內域自磷酸化，導致受體的活化，于是細胞質內底物被磷酸化和啟動多種細胞反應的信號級聯，包括基因表達的改變，細胞骨架的重排，凋亡的抑制和細胞增殖的促進.而在腫瘤中，EGFR 過表達或結構的改變均可使EGFR 信號失去控制.EGFR 過表達也成為頭頸癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌和食管癌的強有力的預后指標之一.在胃癌、乳腺癌和結直腸癌中，EGFR 的表達水平估測預后的價值相對較低[2].而在非小細胞肺癌（NSCLC）中，EGFR 高表達估測預后的價值尚存爭議.EGFR 的突變也在腫瘤的發生和進展中起重要作用，常決定腫瘤對EGFR抑制劑的應答，這有助于篩選合適的患者并給予個體化治療.

3 EGFR與自噬

EGFR 不僅在細胞膜上表達從而發揮功能，還經過內吞作用進入細胞質.細胞質內EGFR 或與內含體融合進而降解和回收利用，或轉移至線粒體、細胞核發揮作用.

3.1 細胞膜EGFR調節細胞自噬通路

3.1.1 EGFR-PI3K-AKT-mTOR 通路

I 型磷脂酰肌醇三激酶（PI3K-I）是一個脂類激酶，被招募到活化的EGFR 上，并發生磷酸化作用.活化的PI3K-I 磷酸化磷脂酰肌醇2 磷酸（PIP2）為磷脂酰肌醇3 磷酸（PIP3），三磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶-1（PDK1）將蛋白激酶B（AKT）帶到PIP3 所在的質膜上并磷酸化和活化AKT.AKT 隨后活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）.活化的mTORC1 磷酸化多種與自噬啟動和吞噬泡形成有關的蛋白例如ULK1、ATG13、AMBRA1 和ATG14.活化的mTORC1 也磷酸化轉錄因子TFEB，阻止其調節溶酶體和自噬基因的表達.最終，mTORC1 活化的結果是抑制自噬[3].

3.1.2 EGFR-RAS-ERK 通路

EGFR 經自身磷酸化后，通過結合生長因子受體結合蛋白2（GRB2）來活化鳥苷酸交換因子（SOS），SOS 使腫瘤蛋白Ras-GDP 轉變為激活狀態的Ras-GTP，后者最終活化胞外信號相關激酶（ERK）.ERK 上調Bcl-2 家族成員Noxa 來競爭性結合該家族另一成員MCL1，從而使Beclin1 從其與MCL1 的結合中游離出來并發揮促進自噬的作用[4].

3.1.3 EGFR-JAK2-STAT3 通路

活化的EGFR 激活janus 激酶2（JAK2）來磷酸化信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）的第705 位酪氨酸殘基[5].STAT3 在細胞內定位不同，調節自噬的機制也不同.核內STAT3 通過提高多種自噬負調控因子（例如BCL2、BCL2L1、MCL1）的表達或者下調重要的自噬相關基因（例如Beclin1 和VPS34）來抑制自噬；而胞質內STAT3 通過分離真核翻譯啟動子2α 激酶2（EIF2AK2）、叉形頭蛋白O1（FOXO1）和叉形頭蛋白O3（FOXO3）來抑制自噬；線粒體內STAT3 通過抑制ROS 的產生來抑制自噬[6].

3.2 內含體EGFR與細胞自噬

Beclin1 是一個盤曲螺旋的蛋白，參與哺乳類動物細胞的自噬，是III 型磷脂酰肌醇三激酶（PI3K-III）復合物的其中一個成分.活化的EGFR 除可通過PI3K-AKT-mTOR 通路間接經由Beclin1 參與自噬的調節外，也可直接與Beclin1 相互作用，以不依賴mTOR 的方式調節自噬.活化的EGFR 首先經內吞作用進入細胞質，再與Beclin1 結合，使Beclin1 的Y229，Y233 和Y352 位點的酪氨酸磷酸化，增強Beclin1 與自噬負調控因子（例如Bcl-2 和Rubicon）的結合并減弱Beclin1 與VPS34 的結合，從而抑制自噬[7].而Tan 等研究發現，非活化的EGFR 也可參與自噬的調節.在血清饑餓下，非活化的EGFR與癌蛋白LAPTM4B 和囊泡外亞復合物成分Sec5 在內含體上形成復合物，該EGFR 復合物結合Rubicon，使得Beclin1 從Rubicon 中游離出來，從而啟動自噬[8].

3.3 細胞核內EGFR參與細胞自噬調節

胞膜上EGFR 轉運至細胞核可分為如下過程.首先是EGFR 經內吞作用進入細胞質，然后在動力蛋白的推動作用下沿著微管運動至高爾基體，最后EGFR 與高爾基體融合并繼續沿著微管運動至細胞核[9].電離輻射可促使胞膜上EGFR 的核內轉運，核內EGFR 活化DNA 依賴的蛋白激酶（PRKDC）來修復輻射誘導的DNA 雙鏈破壞[10].若在電離輻射處理膠質瘤細胞的基礎上抑制PRKDC 的表達，將導致大量的自噬性細胞死亡[11].然而，EGFR 的核內轉移參與自噬調節還有待進一步的研究.

3.4 線粒體EGFR的非激酶依賴性自噬調節

在表皮生長因子激活下，EGFR 磷酸化并與非受體型酪氨酸激酶c-Src 共同轉移到線粒體.定位到線粒體的c-Src 隨后磷酸化EGFR 的第845 位酪氨酸殘基并允許后者結合和磷酸化線粒體編碼的細胞色素C 氧化酶亞基II（CoxII）.磷酸化的CoxII 活性降低，抑制線粒體產生ATP 和ROS[12].線粒體EGFR 也可促進線粒體的增殖及線粒體在細胞偽足的聚集、誘導ATP 的產生和增強細胞的運動能力，從而導致腫瘤細胞的侵襲和遠處轉移[13].ATP 和ROS 均是自噬調節因子：1）細胞內的AMP/ATP 比例升高能夠活化AMPK信號，從而增強自噬.2）ROS 通過結合或氧化ATG4 的第81 位半胱氨酸殘基來防止LC3-I 脫脂化，從而促進自噬[14].然而，線粒體EGFR 通過調節線粒體ATP 和ROS 的產生來影響自噬的機制仍需充分研究.

4 EGFR抑制劑與腫瘤耐藥

目前EGFR抑制劑主要以抑制特定的EGFR 酪氨酸激酶（EGFR-TKIs）的小分子抑制劑和以中和胞外EGFR 受體的單克隆抗體為主.EGFR-TKIs 如厄洛替尼、吉非替尼等用于治療NSCLC 已有10 多年，取得了不錯的療效.與化療藥相比，EGFR-TKIs 在帶有活化突變的NSCLC 患者中顯示有更高的應答率、更長的無進展生存期和更高的生活質量[15]，然而，最終大多數患者會對這些藥物產生不同程度的耐藥.不同于NSCLC，頭頸癌很少帶有EGFR 活化突變.c-Src 的活化作為EGFR 旁路途徑介導頭頸癌對厄洛替尼耐藥，但并不影響其對西妥昔單抗的敏感性[16].在國外，EGFR-TKIs 與傳統化療藥被聯合用于治療晚期胰腺癌.有研究發現，帶有EGFR 突變的胰腺癌患者更可從聯合用藥中獲益[17].但也有研究得出相反的結論，該聯合用藥并不比單藥化療更有效[18].因而，EGFR-TKIs臨床用于治療晚期胰腺癌仍需謹慎，并且仍需多國臨床試驗進一步研究.盡管EGFR-TKIs對治療胰腺癌可能有效，腫瘤的耐藥問題難以避免，有報道表明胰腺癌對EGFR-TKIs耐藥與PI3K/AKT/mTOR 通路的過度活化有關[19].在其它腫瘤的治療中，由于先天性或獲得性耐藥，EGFR-TKIs 的療效也并不樂觀.腫瘤細胞對EGFR-TKIs 耐藥的主要機制可被劃分為這三類：改變EGFR 這一藥物靶點、改變相關的下游信號通路、改變其它的受體酪氨酸激酶作為EGFR 阻斷的補償旁路.最常見的耐藥機制是T790M 突變，它占據50%-60%的獲得性耐藥病例.第二個最常見的獲得性耐藥機制是HER2 擴增，它占據12%的病例.然后是c-Met 擴增和PIK3CA 突變，各占據5%的病例[20].

西妥昔單抗和帕尼珠單抗均是抗細胞外域EGFR 的單克隆抗體，它們阻斷配體與EGFR 的結合，導致下游RAS-RAF-MEK-ERK 信號通路的抑制.已有數個臨床隨機試驗表明這兩種抗體與傳統的化療方案聯合應用可延緩帶有野生型克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）的轉移性結直腸癌（mCRC）患者的疾病進展，然而，大多數患者的腫瘤最終都難免因耐藥問題而加快進展.Morelli 等研究發現KRAS 的獲得性耐藥突變見于44%帶有野生型KRAS 的患者，并且在抗EGFR 治療后帶有低頻率突變KRAS的患者的無進展生存期更短[21].此外，KRAS 獲得性耐藥突變的腫瘤細胞可大量分泌轉化生長因子-α（TGF-α）作用于鄰近非耐藥突變細胞，TGF-α 與EGFR 結合并導致ERK 信號的持續激活，從而介導敏感細胞的耐藥[22].EGFR 的糖基化與甲基化修飾均可影響腫瘤對抗EGFR 單抗的敏感性.缺乏唾液酸糖基化的EGFR-K521變體因穩定性及與西妥昔單抗的親和力下降而介導頭頸癌對西妥昔單抗耐藥[23].淋巴毒素-β 與R198 和R200 位點甲基化的EGFR 相互作用，增強甲基化介導的EGFR 與配體的結合和EGFR 的二聚化，從而促進西妥昔單抗耐藥的發生[24].PI3K/AKT/mTOR 通路的組成性活化也可能與抗EGFR 治療的耐藥有關.作為PI3K-I 催化亞基的PIK3CA，已被數項研究評價其突變作為預測抗EGFR 治療耐藥的潛在價值，但該預測價值仍需大型隨機對照試驗來證實.受體酪氨酸激酶c-MET 和ERBB2 的基因異常也與腫瘤耐藥有關，它們被認為是獲得性耐藥的旁路機制.近些年，隨著自噬和EGFR抑制劑的不斷探索與研究，人們發現自噬參與EGFR抑制劑耐藥的發生或影響其治療效果.為此，揭露確切的EGFR抑制劑耐藥機制以及探索有效的抗耐藥治療策略是臨床的迫切需要.

5 自噬與EGFR抑制劑耐藥

在維持細胞內環境穩定中發揮重要作用的自噬，在腫瘤EGFR抑制劑耐藥過程中發揮著雙重作用.一方面，自噬通過移除破壞的細胞成分和蛋白來幫助腫瘤在壓力下生存，導致腫瘤在治療過程產生耐藥；另一方面，自噬加強細胞凋亡的誘導或介導自噬性細胞死亡，導致療效的增強.

5.1 自噬與EGFR-TKIs耐藥

已有數項研究證實自噬介導腫瘤細胞對EGFR-TKIs 耐藥，此時抑制自噬可逆轉腫瘤的耐藥.Liu 等研究發現，抑制自噬可增強三陰性乳腺癌（雌激素受體、孕激素受體和HER2 表達均為陰性）細胞的凋亡，從而使腫瘤對吉非替尼的敏感性提高[26].自噬抑制劑與EGFR-TKIs 的聯合使用也可因增強細胞凋亡而逆轉膀胱癌細胞對EGFR-TKIs 耐藥[27].此外，自噬的增強也見于對厄洛替尼耐藥的NSCLC 細胞，而因抑制自噬導致的細胞凋亡可由內質網應激介導[28].有研究表明，厄洛替尼誘導的自噬并不完全依賴于Beclin1 的經典自噬，用siRNA 敲除ATG5 而非Beclin1 可顯著降低腫瘤細胞的生存率，該結果暗示非經典的自噬也可能參與腫瘤對EGFR-TKIs 耐藥[29].由于腫瘤細胞糖酵解活性強，糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2DG）可增強厄洛替尼的體外細胞毒性作用，然而在體內卻相反，2DG 可通過內質網應激介導的自噬水平的提高來減弱厄洛替尼的抗腫瘤作用[30].腫瘤獲得性耐藥的發生是復雜的，許多報告表明P-糖蛋白（MDR1）的過表達和自噬的上調是主要原因.裝載有吉非替尼和氯喹且共軛結合了抗MDR1 單克隆抗體的殼聚糖納米顆粒不僅可通過氯喹的作用抑制自噬，還可通過抗MDR1 單克隆抗體的作用提高吉非替尼進入細胞內的濃度，最終誘導顯著的細胞凋亡.此外還發現，氯喹抑制自噬的同時，MDR1 的表達顯著減少，暗示自噬可能調節MDR1 蛋白在獲得性耐藥的作用[31].

然而，另一些研究卻顯示自噬抑制介導腫瘤細胞對EGFR-TKIs 耐藥，此時聯合使用自噬誘導劑和EGFR-TKIs 可以提高療效.植物精油成分日扁柏素可誘導細胞DNA 破壞和自噬來逆轉肺腺癌細胞對吉非替尼耐藥，若用3-MA 抑制自噬則使日扁柏素的抗腫瘤作用減弱[32].另外，其它一些具有抗腫瘤活性的藥物也具有誘導自噬的作用，例如酪蛋白激酶2（CK2）抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑.CK2 抑制劑CX-4945 能誘導吉非替尼/厄洛替尼耐藥的NSCLC 細胞的自噬并可使EGFR 從細胞膜轉移到自噬體中，最終導致胞膜EGFR 的減少.在克服T790M 介導的EGFR-TKIs 耐藥中，CX-4945 誘導的自噬可能與EGFR-TKIs 協同抑制EGFR 信號[33].組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA 和EGFR-TKIs 的聯合應用能增強T790M 突變的NSCLC 細胞的自噬和凋亡，而抑制細胞自噬將顯著減少聯合治療誘導的細胞凋亡.另外，該聯合治療也誘導不依賴于半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的自噬性細胞死亡[34].

5.2 自噬與抗EGFR單克隆抗體耐藥

EGFR 靶向抗體除可結合于EGFR 胞外域，阻斷配體結合和EGFR 的活化，還能夠介導EGFR 的內化.西妥昔單抗能夠促使胞膜表面的EGFR 轉移到內質網和細胞核內，而EGFR 的核內定位與腫瘤抗EGFR 治療后的獲得性耐藥有關.此外，西妥昔單抗還可激發多種腫瘤細胞系的保護性自噬以介導耐藥，例如，Li 等發現西妥昔單抗能夠通過抑制PI3K-I/AKT/mTOR 信號通路以及增強Vps34/Beclin1 信號通路來誘導腫瘤細胞自噬以應對凋亡壓力[35].自噬的誘導也見于頭頸癌在抗EGFR 治療后，通過新型自噬抑制劑spautin-1 高效且特異性地促進Vps34-Beclin1 復合物的降解能夠增強抗EGFR 單抗抑制腫瘤細胞生長的作用[36].相反地，自噬也有對腫瘤不利的一面.有研究表明，西妥昔單抗與環氧合酶-2（COX-2）抑制劑聯合應用能夠導致抗EGFR 單抗天然耐藥的結直腸癌細胞的自噬性細胞死亡[37].過度的自噬可造成腫瘤細胞死亡，因而腫瘤可能通過某些機制抵消抗EGFR 單抗誘導的過度自噬來介導耐藥.自噬不僅與細胞內多條控制細胞增殖或凋亡的分子通路有關聯，也與EGFR 的亞細胞定位存在一定的聯系，靶向自噬抑制EGFR 的內化，阻斷EGFR 進入細胞核和阻礙EGFR 的核內作用（例如DNA 修復機制），也可能是逆轉腫瘤抗EGFR 單抗耐藥的可行策略.

6 總結與展望

EGFR抑制劑由于其選擇性高，療效獨特和毒性較小等特點，為治療癌癥開辟了一條新途徑.然而，這些藥物終將面臨腫瘤耐藥的問題.近些年來越來越多的研究證明，細胞自噬與腫瘤EGFR抑制劑耐藥有關.一些研究證明，自噬的增強可介導腫瘤EGFR抑制劑耐藥，同時抑制自噬和EGFR 可協同誘導腫瘤細胞的死亡.另一些研究則證明，自噬的抑制與腫瘤EGFR抑制劑耐藥有關，增強自噬可誘導耐藥細胞的凋亡或自噬性細胞死亡.盡管抑制自噬介導腫瘤對EGFR抑制劑耐藥的相關研究較少，但卻不容忽視.因此，如何正確聯合應用自噬調節藥與EGFR抑制劑，對于克服腫瘤耐藥是至關重要的.

未來的研究應該關注這幾方面：（1）尋找有效和明確的指標來指導自噬調節藥與EGFR抑制劑聯合應用的時機；（2）研究EGFR 甲基化與糖基化修飾在腫瘤EGFR抑制劑耐藥中的作用；（3）研究自噬在EGFR抑制作用中的具體機制以及自噬在EGFR 亞細胞定位的作用；（4）自噬在P-糖蛋白介導獲得性耐藥過程的機制以及自噬在調節表觀遺傳修飾的作用，也是值得研究的方向；（5）考慮到體內組織中的腫瘤通常處于缺氧環境，自噬的研究建立在腫瘤缺氧模型上是有著重要意義的；（6）腫瘤EGFR抑制劑耐藥機制也需進一步的探索.

表1 腫瘤EGFR抑制劑耐藥機制及調節自噬逆轉耐藥方式

致謝感謝藍展鵬、周珂和戴澤宇對本文提出寶貴意見和修改！