肺癌患者血漿檢測腫瘤標志物的分析方法及展望

魏優蕾 郭曉彤

摘要：非小細胞肺癌（NSCLC）患者進行靶向治療前需要鑒定多種生物標志物，包括EGFR、ALK、ROS-1和PD-L1，通常經手術、穿刺等途徑獲取樣本。液體檢測是目前新興的腫瘤標記物檢測方法，它可以從血漿中提取出循環系統中的腫瘤DNA（ctDNA），具有低風險、取樣簡單、術后不適感少等優點。常用的液體活檢方法有定量聚合酶鏈反應（PCR）、數字PCR技術、新一代測序技術（NGS）。本文簡要地闡述了上述分析方法的研究進展及未來應用方向。

關鍵詞：肺癌;腫瘤標志物;液體檢測

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.014

文章編號：1006-1959（2019）07-0039-05

Abstract：Non-small cell lung cancer （NSCLC） patients need to identify a variety of biomarkers， including EGFR， ALK， ROS-1 and PD-L1， before they are targeted. Usually， the samples are obtained by surgery， puncture and other means. Liquid detection is an emerging method for detecting tumor markers. It can extract tumor DNA （ctDNA） from the circulatory system from plasma， and has the advantages of low risk， simple sampling， and less postoperative discomfort. Commonly used liquid biopsy methods are quantitative polymerase chain reaction （PCR）， digital PCR technology， and next-generation sequencing technology （NGS）. This paper briefly describes the research progress and future application directions of the above analytical methods.

Key words：Lung cancer;Tumor markers;Liquid detection

目前個體化醫療模式已經徹底改變了肺癌的診斷和治療方式。明確腫瘤病理類型，采取相應最佳治療方案是肺癌治療的基本準則。生物標志物的檢測對于免疫、靶向等治療至關重要，其中包括目前比較熱門的EGFR、ALK和ROS -1等。雖然肺癌的診斷和治療方面已經取得了重大進展，但肺癌的延遲診斷問題日益凸顯[1]。晚期（ⅢB-Ⅳ）非小細胞肺癌（NSCLC）患者在肺癌分期總人群中占有更高比例。細胞學標本或組織是唯一可用于形態學診斷和分子評估的材料[2，3]。據統計，高達30%的晚期NSCLC患者難以獲取有效活組織標本[4]。在此條件下進行標志物檢測極具挑戰性而非侵入性“液體活檢”技術可以避免上述問題，并且具有應用范圍廣、快速高效、低操作風險等優勢[5]。血漿來源的循環腫瘤DNA（ctDNA）是目前許多研究用于非小細胞肺癌患者的主要樣本來源[6-11]，通過液體活檢技術對血漿ctDNA進行EGFR檢測;應用血漿ctDNA檢測外顯子20 EGFR點突變（p.T790M）的耐藥情況。上述實驗表明液體活檢技術可以用于指導酪氨酸激酶抑制劑（TKI）用藥。主要缺點是血液樣本中ctDNA含量較低，僅占總細胞游離DNA的<0.5%[12]。因此需要提高靈敏度技術避免假陰性風險、詳細的臨床驗證減少假陽性情況的發生。本綜述的目的是提供目前用于肺癌患者ctDNA分析臨床實踐方法的最新信息。

1 ctDNA的檢測方法

1.1 ctDNA的收集和提取? 液體活檢獲得數據質量的高低取決于以下3個關鍵步驟：抽血、ctDNA離心和ctDNA提取。

抽血和血漿分離的間隔時間至關重要[13]，在同一實驗室內分析樣本有助于縮短抽血、ctDNA離心和ctDNA提取之間的周轉時間。采集管建議使用含EDTA的試管（Vacutainer，BD，Plymouth，UK）以避免凝血，采血量最多10 ml。在外部機構中收集樣本時，建議使用具有不含甲醛的防腐劑、減少非腫瘤循環細胞釋放基因組DNA、抑制ctDNA降解、在室溫下儲存樣品等優點的PAXgene Blood DNA管（Qiagen，Hilden，Germany）或Cell-Free DNA BCT管（Streck，La Vista，NE，USA）[14，15]。Toro PV等的研究所證明[14]，BCT管可以防止細胞在抽血后7 d內溶解，效果較PAXgene管好。

采血后關鍵點在于收集后1 h內離心血漿。ctDNA具有15 min的半衰期，快速離心能確保獲取的血漿和/或血清中具有足夠量的ctDNA，避免假陰性的風險。通常可進行2次離心（2300 rpm，10 min）獲得1.2 ml血漿。也有關于3次離心的報道，如Page K等[16]進行3次離心（條件依次為：1000 g，4℃ 10 min;1000 g或2000 g或10000 g，4℃，10 min;1000 g，室溫，5 min。有研究對11種提取ctDNA的方法進行評估[17，18]，其推薦3種具有高準確度和重復性的試劑盒：QIAamp循環核酸試劑盒（Qiagen）、Norgen血漿/血清循環DNA純化迷你試劑盒、Norgen lasma / Serum無細胞循環DNA純化迷你試劑盒（Norgen，Thorold，ON，Canada）。

1.2定量聚合酶鏈反應? 實時聚合酶鏈反應（PCR）技術是檢測ctDNA常見方式。在此基礎上加以改進，可提高ctDNA檢測的敏感性和特異性[19]。

改良PCR技術的擴增阻礙突變系統（ARMS）。ARMS核心在于突變特異性探針，該探針由連接到3'和5'末端的熒光團和猝滅劑組合而成。存在突變的時，探針與靶位點結合發生聚合酶反應，促使熒光團和猝滅劑分離，熒光含量增加后對其檢測和測量;反之，熒光標記物難以測出[20]。在此基礎上可通過添加等位基因特異性Scorpion引物（ARMS/S）進一步改進PCR技術。這些Scorpion引物具有莖環部分，莖環上有熒光團和猝滅劑。環序列與PCR產物互補，促使莖環的解折疊，在PCR擴增的退火/延伸階段期間產生熒光[21]。例如：肽核酸（PNA）能夠選擇性聚集突變PCR產物，抑制野生型等位基因的擴增[22]。

ARMS/S技術用于ctDNA中EGFR突變檢測的具有較高的特異性和較低的靈敏性。Kimura H等[23]將此項技術應用于42例NSCLC患者的配對的腫瘤血清樣品中，僅發現3例不一致病例，證實ARMS/S技術的具有高度特異性;IPASS研究表明ARMS/S具有高特異性（100%，ctDNA無假陽性結果）而EGFR突變靈敏度較低（43.1%），可能由使用血清樣本替換血漿樣本造成的差異[24];Douillard JY等[25]分析了從NSCLC患者血漿樣本中提取的ctDNA，靈敏度為65.7%。因此以血漿代替血清為介質可以減少假陰性結果，提高檢測的靈敏度。

此外，PNA改良的ARMS/S技術可顯著提高ctDNA檢測的靈敏性及特異性。Karachaliou N等[6]提出PNA介導的5'核酸酶實時PCR（TaqMan）具有78%的靈敏度和100%的特異性;Pasquale R等人采用的PNA鉗技術[26]，結果證實特異性為100%，靈敏度為65.4%;Thress KS等[27]實驗報告了EGFR突變的高敏感性（82%～87%）和特異性（97%），同時也獲得了耐藥點突變p.T790M的較低靈敏度（73%）和特異性（67%）。上述實驗結果印證ARMS/S技術能夠有效提高PCR檢驗報告的質量。

1.3數字PCR技術? 數字PCR（dPCR）是一種能夠在單分子水平上進行鑒定和定量各種突變基因的新技術。該技術通過熒光探針對目標序列進行拷貝并實現量化[28]。到目前為止已經研發了多種型號，包括數字液滴PCR（ddPCR）、數字固體PCR（dPCR）和微珠、乳液、擴增和磁性（BEAMing）[29]。

dPCR在血漿檢測ctDNA相關標記物特異性和敏感性的相關研究。Yung TK等[30]使用dPCR方法從EGFR外顯子19缺如以及外顯子21 p.L858R的血漿樣品中提取的ctDNA并進行檢測。通過與組織樣本比較，血漿樣本能夠實現92%的敏感性和100%的特異性。結果表明dPCR檢測血漿ctDNA具有一定的敏感性和特異性。

然而，Sacher AG等[31]從兩組患者的血漿樣本中提取ctDNA并行ddPCR檢測。其中一組為基線測試的患者，另一組為疾病進展評估的患者。從基線組群中的組織進行活檢，活檢分兩種情況：初始組織活檢和疾病進展的組織再次活檢。最終獲得的結果與從ctDNA樣品獲得的結果進行比較。對EGFR敏感和KRAS突變的特異性和陽性預測值高達100%，而敏感性為64%至86%。對于EGFR p.T790M突變的敏感性、特異性和陽性預測值分別為77%、63%、79%;Thress KS等采用BEAMing法[27]證實在變異試驗中，EGFR外顯子19缺如的cobas EGFR與外顯子21 p.L858R的cobas? EGFR有相同的靈敏度和特異性。與cobas? EGFR變異試驗相比，BEAMing對p.T790M突變的ctDNA檢測有更高的靈敏性（81%）和更低的特異性（58%）。因此dPCR在血漿檢測靈敏性和特異性與檢測相關標記物不同而有所差異。

Oxnard GR等[32]應用BEAMing法提取ctDNA樣本，對血漿基因分型和腫瘤中心組織分析結果比較，表明p.T790M的ctDNA檢測靈敏度為70%，特異性為69%。猜測組織腫瘤樣本中p.T790M突變的變異組織分布差異導致了檢測的低特異性[32，33]。隨后他們通過正交分析驗證上述猜想：在18個不一致病例中78%的患者存在p.T790M突變（血漿陽性/組織陰性）。結果證實血漿ctDNA分析法具有低靈敏度和假陰性的可能性。因此，建議dPCR對血漿標本pt790M陰性的患者進行多次檢測以降低假陰性的發生率。

1.4下一代測序技術? 近年研究已經將下一代測序技術（NGS）應用于液體活檢領域。NGS 是一種高通量方法，能夠在一次運行中同時對不同患者的不同基因靶點進行快速測序[34，35]。NGS的基本工作流程按照DNA庫的生成、單個片段的克隆擴增、大規模平行測序和數據統計分析的順序進行[36，37]。用NGS對血漿ctDNA檢測相關研究層出不窮，隨著研究深入，NGS技術在液體活檢領域逐步改良并趨于成熟。

用個體化基因組測序儀（PGM）從血漿樣品中提取的測序的ctDNA，并以腫瘤組織樣本中鑒定的DNA突變作為參考，得出結論：NGS的敏感性為58%，特異性為87%[38]。表明NGS在ctDNNA檢測中具有較低的靈敏度和較高的特異性。NReckamp KL等[39]用短足突變增加NGS聚集進而改良NGS技術并取得更佳的檢測靈敏性和特異性（p.T790M、p.L858R和外顯子19缺如的靈敏度分別為93%、100%和87%）。由此改善了液體活檢分析的性能。

此外，NGS技術還有其特有優勢。Paweletz CP等[40]進行了定向NGS測定實驗，結果顯示定向NGS不僅能夠使目標讀數最大化，還能使血漿來源的ctDNA中的偽影最小化;通過使用ddPCR和靶向NGS這兩種方法，對29例EGFR和KRAS已知突變狀態的患者的ctDNA血漿樣本（組織分析）進行分析，結果顯示EGFR和KRAS的敏感性分別為86%和79%。值得注意的是，NGS測定法對兩種類型突變的特異性均高達100%;最后對48例病例含有62種目前已知的突變因子患者分析，結果顯示此方法的驅動突變敏感性為77%、耐藥突變的敏感性為100%。研究結果證實NGS檢測血漿ctDNA的靈敏度雖然欠佳，但在精確性、特異性較為可靠，尤其是在EGFR和KRAS相關突變的敏感性等方面具有良好的表現。Newman AM等[41]通過深度測序（CAPP-Seq）法分析在NSCLC的不同階段收集的血漿中的ctDNA結果表明Ⅰ期腫瘤的診斷敏感性為50%，Ⅱ-Ⅳ期腫瘤為100%，所有階段的總體敏感性為85%、特異性為96%。NGS技術可應用于不同階段肺癌患者，結果比較可靠準確。

上述研究證實了使用靶向NGS檢測肺癌中的ctDNA的可行性，尤其是在初始分子評估和監測等方面表現出良好的敏感性和特異性，并且具有多樣本平行檢測、檢測速度快和適用范圍廣等特點。

2對ctDNA中的EGFR突變結果的分析

警惕ctDNA測定的低敏感性（組織陽性患者出現的假陰性結果）和特異性（組織陰性患者出現的假陽性結果）情況。在復發的腫瘤組織中，p.T790M突變的異質性分布限制了ctDNA檢測的準確性[42，43]。腫瘤異質性分布影響檢測結果質量;在AURA實驗中，血漿來源的ctDNA中檢測為p.T790M陰性，而組織樣本中p.T790M陽性，但陽性結果組具有更高的客觀反應率和更長的中位無進展生存期[32，33]。血漿假陰性結果干擾ctDNA檢測的可靠性。

盡管存在上述問題，血漿檢測法在EGFR活化或耐藥性突變等方面的檢測還是非常可靠的。通過正交技術進行重復檢測可輕易地避免假陰性結果的問題[42]。因此，在進行液體活檢后，p.T790M ctDNA陽性的患者可以進行第三代TKI（例如osimertinib）治療，而陰性結果的患者則應進行重復檢測，以排除假陰性結果的可能性。

3總結及展望

診斷延遲是當今干擾肺癌治療重要問題之一，直接影響肺癌的早期治療措施的實施，進而造成較差的預后;組織活檢法和細胞學活檢法在診斷晚期NSCLC方面具有極高的挑戰性。主要原因在于組織活檢不能取到有效的能夠反映疾病類型的組織樣本，細胞學活檢則通常情況下很難取到有意義的組織細胞。而ctDNA液體活檢法可以有效地解決上述問題。采用高靈敏度檢測技術能夠有效限制液體活檢法的假陰性和假陽性結果的產生。定量PCR（qPCR）是目前比較推崇的方法，并且近期的幾項臨床試驗同樣證明了液體活檢在評估NSCLC患者EGFR突變中發揮了重要作用。盡管如此，由于血液中突變等位基因的含量低，該方法可能會因低敏感性而影響其結果可靠性。但是在未來，我們希望NGS這樣的尖端技術能夠消除這種限制，能夠在更多的患者中同時識別更多類型的基因突變（ALK、ROS-1、RET易位、BRAF突變、MET 外顯子14缺如）、融合和易位。使腫瘤學家夠以此鑒定腫瘤學標志物，并為NSCLC患者定制個體化治療方案。

雖然本次綜述重點敘述了肺癌患者ctDNA的主要方法，并將無創檢測法應用并擴展到NSCLC患者的診斷、治療及管理的不同環境中（如治療效果、并發癥、復發情況的跟蹤監測等）。但不能排除體液中其他診療相關的生物學靶點在肺癌治療中的作用，如循環中的腫瘤細胞、血小板相關核酸以及與腫瘤相關的其他成分（如尿液、痰液和體液）。

參考文獻：

[1]Hida T，Nokihara H，Kondo M，et al.Alectinib versus crizotinib in patients with ALK-positive nonsmall-cell lung cancer（J-ALEX）：an open-label，randomised phase 3 trial[J].Lancet，2017， 390（10089）：29-39.

[2]Shaw AT，Ou SH，Bang YJ，et al.Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J].N Engl J Med，2014，371（21）：1963-1971.

[3]Wang S，Yu B，Ng CC，et al.The suitability of small biopsy and cytology specimens for EGFR and other mutation testing in non-small cell lung cancer[J].Transl Lung Cancer Res，2015，4（2）：119-125.

[4]Malapelle U，Bellevicine C，De Luca C，et al.EGFR mutations detected on cytology samples by a centralized laboratory reliably predict response to gefitinib in non-small cell lung carcinoma patients[J].Cancer Cytopathol，2013，121（10）：552-560.

[5]Sacher AG，Komatsubara KM，Oxnard GR.Application of Plasma Genotyping Technologies in Non-Small Cell Lung Cancer： A Practical Review[J].J Thorac Oncol，2017，12（9）：1344-1356.

[6]Karachaliou N，Mayo-de las Casas C，Queralt C，et al.Association of EGFR L858R Mutation in Circulating Free DNA With Survival in the EURTAC Trial[J].JAMA Oncol，2015，1（2）：149-157.

[7]Malapelle U，Pisapia P，Rocco D，et al.Next generation sequencing techniques in liquid biopsy：focus on non-small cell lung cancer patients[J].Transl Lung Cancer Res，2016，5（5）：505-510.

[8]Malapelle U， Mayo de-Las-Casas C，Rocco D，et al.Development of a gene panel for next-generation sequencing of clinically relevant mutations in cell-free DNA from cancer patients[J].Br J Cancer，2017，116（6）：802-810.

[9]Pantel K，Speicher MR.The biology of circulating tumor cells[J].Oncogene，2016，35（10）：1216-1224.

[10]Rolfo C，Giallombardo M，Reclusa P，et al.Exosomes in lung cancer liquid biopsies：two sides of the same coin？[J].Lung Cancer，2017（104）：134-135.

[11]Crowley E，Di Nicolantonio F，Loupakis F，et al.Liquid biopsy： monitoring cancergenetics in the blood[J].Nat Rev Clin Oncol，2013，10（8）：472-484.

[12]Mead R，Duku M，Bhandari P，et al.Circulating tumour markers can define patients with normal colons， benign polyps， and cancers[J].Br J Cancer，2011，105（2）：239-245.

[13]Normanno N，Denis MG，Thress KS，et al.Guide to detecting epidermal growth factor receptor （EGFR） mutations in ctDNA of patients with advanced non-smallcell lung cancer[J].Oncotarget，2017，8（7）：12501-12516.

[14]Toro PV，Erlanger B，Beaver JA，et al.Comparison of cell stabilizing blood collection tubes for circulating plasma tumor DNA[J].Clin Biochem，2015，48（15）：993-998.

[15]Schmidt B，Reinicke D，Reindl I，et al.Liquid biopsy-Performance of the PAXgene? ?Blood ccfDNA Tubes for the isolation and characterization of cell-free plasma DNA from tumor patients[J]. Clin Chim Acta，2017（469）：94-98.

[16]Page K，Guttery DS，Zahra N，et al.Influence of plasma processing on recovery and analysis of circulating nucleic acids[J].PLoS One，2013，8（10）：e77963.

[17]Tie J，Kinde I，Wang Y，et al.Circulating tumor DNA as an early marker of therapeutic response in patients with metastatic colorectal cancer[J].Ann Oncol，2015，26（8）：1715-1722.

[18]Mauger F，Dulary C，Daviaud C，et al.Comprehensive evaluation of methods to isolate， quantify， and characterize circulating cell-free DNA from small volumes of plasma[J].Anal Bioanal Chem，2015，407（22）：6873-6878.

[19]Mayo-de-Las-Casas C，Garzón Ibánez M，Jordana-Ariza N，et al.An update on liquid biopsy analysis for diagnostic and monitoring applications in non-small cell lung cancer[J].Expert Rev Mol Diagn，2018，18（1）：35-45.

[20]Douillard JY，Ostoros G，Cobo M，et al.Gefitinib treatment in EGFR mutated caucasian NSCLC：circulating-free tumor DNA as a surrogate for determination of EGFR status[J].J Thorac Oncol，2014，9（9）：1345-1353.

[21]Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2006，12（13）：3915-3921.

[22]Kim HR，Lee SY，Hyun DS，et al.Detection of EGFR mutationsin circulating free DNA by PNA-mediated PCR clamping[J].J Exp Clin Cancer Res，2013，32（1）：50.

[23]Kimura H，Suminoe M，Kasahara K，et al.Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serum DNA as a predictor of response to gefitinib（IRESSA）[J].Br J Cancer，2007，97（6）：778-784.

[24]Goto K，Ichinose Y，Ohe Y，et al.Epidermal growth factor receptor mutation status in circulating free DNA in serum： from IPASS，a phase Ⅲ study of gefitinib or carboplatin/paclitaxel in non-small cell lung cancer[J].J Thorac Oncol，2012，7（1）：115-121.

[25]Douillard JY，Ostoros G，Cobo M，et al.First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients： a phase-IV，open-label，single-arm study[J].Br J Cancer，2014，110（1）：55-62.

[26]Pasquale R，Fenizia F，Esposito Abate R，et al.Assessment of high-sensitive methods for the detection of EGFR mutations in circulating free tumor DNA from NSCLC patients[J].Pharmacogenomics，2015，16（10）：1135-1148.

[27]Thress KS，Brant R，Carr TH，et al.EGFR mutation detection in ctDNA from NSCLC patient plasma：A cross-platform comparison of leading technologies to support the clinical development of AZD9291[J].Lung Cancer，2015，90（3）：509-515.

[28]Malapelle U，de Luca C，Vigliar E，et al.EGFR mutation detection on routine cytological smears of non-small cell lung cancer by digital PCR：a validation study[J].J Clin Pathol，2016，69（5）：454-457.

[29]Vendrell JA，Mau-Them FT，Béganton B，et al.Circulating Cell Free Tumor DNA Detection as a Routine Tool forLung Cancer Patient Management[J].Int J Mol Sci，2017，18（2）：18.

[30]Yung TK，Chan KC，Mok TS，et al.Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients[J].Clin Cancer Res，2009，15（6）：2076-2084.

[31]Sacher AG，Paweletz C，Dahlberg SE，et al.Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer[J].JAMA Oncol，2016，2（8）：1014-1022.

[32]Oxnard GR，Thress KS，Alden RS，et al.Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib （AZD9291） in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer[J].J Clin Oncol，2016，34（28）：3375-3382.

[33]Mok TS，Wu YL，Ahn MJ，et al.AURA3 Investigators.Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer[J].N Engl J Med，2017，376（7）：629-640.

[34]Bentley DR，Balasubramanian S，Swerdlow HP，et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry[J].Nature，2008，456（7218）：53-59.

[35]Rothberg JM，Hinz W，Rearick TM，et al.An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing[J].Nature，2011，475（7356）：348-352.

[36]Li J，Batcha AM，Grüning B，et al.An NGS Workflow Blueprint for DNA Sequencing Data and Its Application in Individualized Molecular Oncology[J].Cancer Inform，2016，14（Suppl 5）：87-107.

[37]Clinical and Laboratory Standards Institute.Nucleic Acid Sequencing Methods in Diagnostic Laboratory Medicine;Approved Guideline （CLSI document MM09-A2）[M].2nd ed.Wayne（PA）：Clinical and Laboratory Standards Institute，2014.

[38]Couraud S，Vaca-Paniagua F，Villar S，et al.BioCAST/IFCT-1002 investigators.Noninvasive diagnosis of actionable mutations by deep sequencing of circulating free DNA in lung cancer from never-smokers： a proof-of-concept study from BioCAST/IFCT-1002[J].Clin Cancer Res，2014，20（17）：4613-4624.

[39]Reckamp KL，Melnikova VO，Karlovich C，et al.A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma[J].J Thorac Oncol，2016，11（10）：1690-1700.

[40]Paweletz CP，Sacher AG，Raymond CK，et al.Bias-Corrected Targeted Next-Generation Sequencing for Rapid， Multiplexed Detection of Actionable Alterations in Cell-Free DNA from Advanced Lung Cancer Patients[J].Clin Cancer Res，2016，22（4）：915-922.

[41]Newman AM，Bratman SV，To J，et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J].Nat Med，2014，20（5）：548-554.

[42]Normanno N，Maiello MR，Chicchinelli N，et al.Targeting the EGFR T790M mutation in nonsmall-cell lung cancer[J].Expert Opin Ther Targets，2017，21（2）：159-165.

[43]Piotrowska Z，Niederst MJ，Karlovich CA，et al.Heterogeneity Underlies the Emergence of EGFRT790 Wild-Type Clones Following Treatment of T790M-Positive Cancers with a Third-Generation EGFR Inhibitor[J].Cancer Discov，2015，5（7）：713-722.

[44]Remon J，Menis J，Hasan B，et al.The APPLE Trial：Feasibility and Activity of AZD9291（Osimertinib）Treatment on Positive PLasma T790M in EGFR-mutant NSCLC Patients.EORTC 1613[J].Clin Lung Cancer，2017，18（5）：583-588.

收稿日期：2019-1-4;修回日期：2019-1-13

編輯/肖婷婷