基于網絡藥理學的杜仲干預創傷性股骨頭壞死作用機制研究*

田濤濤，石淇允，李無陰

（河南省洛陽正骨醫院/河南省骨科醫院，河南 洛陽 471002）

創傷性股骨頭壞死是髖部受到損傷后引起的嚴重并發癥，多數文獻報道髖部損傷后其出現股骨頭壞死率為12%～86%[1-2]。近年來，以股骨頸骨折為主的髖部損傷疾病逐年上升，且趨于低齡化[3]。目前，多數指南建議對于60歲以上的患者可直接行髖關節置換來降低治療后期出現壞死二次手術的概率。但對于中青年患者尚未形成統一治療方案[4]。中醫藥在治療慢性復雜性疾病具有一定的優勢，部分臨床研究發現運用中醫藥來防治創傷性股骨頭壞死的發生及發展效果良好，但中醫治療講究中藥君臣佐使聯合用藥，在治療創傷性股骨頭壞死也多采用復方[5-6]，因此，臨床中對于每味中藥的貢獻值并不清晰。

杜仲，味甘，性溫，歸肝、腎經，具有補肝腎，強筋骨的作用。現代藥理學已證實其主要含環烯醚萜類、黃酮類、苯丙素類、酚類等成分，但關于其具體作用機制的相關研究較少[7-8]。杜仲治療創傷性股骨頭壞死是多靶點、多環節作用的共同結果，雖然臨床中大量應用杜仲來治療創傷性股骨頭壞死并取得較好的療效，但多數研究仍針對單一的靶點進行分析，這不能全面整體的反應杜仲的作用機制[9-10]。網絡藥理學遵循中醫理論，綜合現代醫學理論與技術，能夠整體、系統的分析杜仲改善創傷性股骨頭壞死的機制。本研究采用網絡藥理學來探索杜仲干預創傷性股骨頭壞死可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺 （TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索關鍵詞“杜仲”獲得其活性成分信息，并設置其口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件進行篩選。

1.2 藥物作用靶點預測與疾病靶點查詢 在U－niprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）UniprotKB 檢索功能對各靶點人類基因簡稱進行查詢，獲取杜仲可能存在的靶蛋白。在GeneCards數據庫（https：//auth.lifemapsc.com）中以“traumatic necrosis of femoral head”為檢索詞進檢索，獲取創傷性股骨頭壞死已知的靶蛋白。

1.3 共同靶點的確定 采用Venny圖獲取藥物（杜仲）靶點與疾病（創傷性股骨頭壞死）靶點的交集為共同靶點。

1.4 成分-靶點網絡構建 將確定的藥物疾病共同靶點導入Cytoscape3.7.2（美國），構建“成分-靶點”網絡圖。

1.5 蛋白相互網絡的構建 將取交集后的靶點導入在線系統 String11.0（http：//string-db.org/），獲得蛋白質相互作用（PPI）網絡。

1.6 生物通路的分析 對杜仲的作用靶標進行基因本體論（GO）分析與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，得到通路富集結果，并繪制典型通路信息圖。

2 結果

2.1 杜仲的活性成分及相應靶蛋白 在TCMSP數據庫中共檢索出147種杜仲活性成分，經過篩選得到符合標準的成分28種。表1。

表1 杜仲生物活性成分

2.2 藥物靶點預測及共同靶點的確定 在Uniprot數據庫中輸入潛在靶標的PDB ID，并剔除重復的基因靶標后共得到102個。在GeneCards數據庫（https：//auth.lifemapsc.com）中以“traumatic necrosis of femoral head”為檢索詞進檢索，獲取創已知的疾病靶點542個。取兩者交集為共同靶點共42個。見圖1、表2。

表2 杜仲潛在靶標

圖1 共同靶點

2.3 成分-靶點與疾病靶點網絡 使用Cytoscape 3.7.2建立杜仲干預創傷性股骨頭壞死網絡圖，見圖2。該圖中有靶蛋白的節點58個，表示相互作用的線149條。

圖2 杜仲干預創傷性股骨頭壞死成分-靶點網絡圖

2.4 蛋白質相互作用網絡構建 使用String數據庫獲取杜仲與創傷性股骨頭壞死相關靶標的相互作用關系，導入Cytoscape軟件，構建靶標相互作用網絡。網絡圖種共包含節點42個，線320條。見圖3。

2.5 GO生物學功能分析 將42個潛在靶點映射到DAVID數據庫中，進行生物學功能富集，系統的分析其生物過程。共富集到65條生物過程，其中P≤0.01的生物過程共有55條。見圖4。

圖3 杜仲干預創傷性股骨頭壞死PPI圖

圖4 GO功能富集分析條形圖

2.6 KEGG通路分析 通過KEGG通路富集分析，篩選出62（P≤0.01）條通路與杜仲防治創傷性股骨頭壞死的作用相關。見圖5。杜仲對PI3K/Akt signaling pathway信號通路作用靶點標注圖。見圖6。

3 討論

創傷性股骨頭壞死是較為復雜的常見骨病之一，其發生發展受多種因素的調控[11]。目前多數治療僅能延緩疾病的進展[12]。中醫認為創傷性股骨頭壞死多屬于腎虛血瘀，是機體收到創傷后導致氣血運行失常，前期以“瘀”為主要病機，疾病發展后期以“虛-瘀”為主要特點[13]。而杜仲是常用的補益類藥物，大量治療創傷性股骨頭壞死的復方中均應用杜仲，但尚無研究提出杜仲為復方中主要改善創傷性股骨頭壞死的藥物。

圖5 KEGG通路富集分析條形圖

圖6 杜仲成分在創傷性股骨頭壞死相關通路中的作用靶點標注圖

本研究采用網絡藥理學的方法，發現杜仲的有效活性成分可能通過調節PTGS1、BCL2、PON1、PPARG、ICAM1等相關靶點來防治創傷性股骨頭壞死[14-16]。這些靶點主要為調控成骨細胞和破骨細胞的代謝平衡、促進或抑制血管的新生和凋亡、改善內環境的炎癥反應等。將預測到的42個目標靶點導入KEGG Pathway數據庫，得到目標靶點在PI3K/Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection等信號通路上的相關調控過程，證實了杜仲多靶點，多途徑的參與防治創傷性股骨頭壞死的發生發展[17-18]。如PI3K/Akt信號通路是調控人體細胞分化、增殖與凋亡的重要信號通路，多數學者認為認為它可能是影響骨轉換的平衡重要通路[19]。

綜上所述，通過網絡藥理學的研究方法能夠證實杜仲可多途徑、多靶點防治創傷性股骨頭壞死的發生發展。杜仲各種活性成分間存在著密切的協同關系，其主要的靶點也在創傷性股骨頭壞死中發揮著至關重要的作用，這將有助于進一步研究中醫藥防治創傷性股骨頭壞死。