蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性

劉娟 馮浩 王帥 高小寧 黃麗麗

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摘要為了明確蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性現狀，本研究采用菌絲生長速率法測定了來自7個省份7個不同年份的106株蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性，并建立了敏感基線。結果表明：供試蘋果樹腐爛病菌菌株的EC50區間在0.003～0.123 μg/mL，敏感性頻率分布呈連續性單峰曲線。經KS法檢驗符合正態分布，未出現敏感性明顯下降的抗性群體，平均EC50 （0.044±0.029） μg/mL可作為蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感基線。不同地理來源的菌株對苯醚甲環唑的敏感性有顯著性差異，來自遼寧省的菌株敏感性最高，河南省的敏感性最低;不同年份的菌株敏感性也有顯著性差異，2009年采集的菌株對苯醚甲環唑的敏感性最高，2016年采集的菌株敏感性最低，菌株對藥劑的敏感性隨年份的推移逐漸降低，說明病菌的抗藥性不斷增強。

關鍵詞蘋果黑腐皮殼菌;菌落直徑;苯醚甲環唑;EC50;抗藥性

中圖分類號：S 436.611.11

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018119

蘋果樹腐爛病（apple Valsa canker）是由蘋果黑腐皮殼屬真菌Valsa mali侵染引起的枝干病害[1]。該病的發生會造成樹皮組織腐爛，樹勢削弱，甚至枝枯樹死，果樹壽命縮短[2]。因其侵染途徑多樣、潛伏性強、致病機理復雜，病害防控困難，治愈率低，被稱為“蘋果的癌癥”[3]。

目前，生產上蘋果樹腐爛病主要依靠刮除病疤后涂抹藥劑或全樹噴淋藥劑等措施進行防治，所用藥劑種類繁多[45]。化學藥劑因其操作簡單，使用方便且見效快而成為防治蘋果樹腐爛病的主要藥劑。其中甲基硫菌靈可以高效預防腐爛病菌的侵染[6]，丁香菌酯能有效抑制蘋果樹腐爛病病疤的復發[7]，戊唑醇能有效抑制蘋果樹腐爛病菌孢子萌發和菌絲生長[8]。而三唑類殺菌劑苯醚甲環唑雖然尚未在蘋果樹腐爛病上登記使用，但是其對腐爛病菌室內效果要強于同類殺菌劑戊唑醇[8]，可以作為防治蘋果樹腐爛病的替代藥劑。

苯醚甲環唑由先正達公司于1989年研發上市，具有高效、廣譜、低毒的特點，對子囊菌門和擔子菌門的病菌有很好的防治效果[9]。其作用機制是抑制真菌細胞膜上的麥角甾醇合成，破壞細胞膜結構，造成功能紊亂，從而達到殺菌的目的[1011]。由于該藥劑作用位點單一，長期反復使用會引起病菌產生抗藥性[12]，被認為是一種具有中等抗性風險的殺菌劑。蘋果黑星病菌Venturia inaequalis、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum對該藥劑已經產生了抗性[1314]。近年來，我國各地蘋果產業區普遍應用苯醚甲環唑等三唑類殺菌劑防治各類真菌病害，是否有抗藥性菌株尚不明確。因此，本研究通過測定采自全國的106株蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性，并比較不同地理來源、不同年份的菌株敏感性差異，以期明確蘋果樹腐爛病菌對該藥劑的敏感性現狀，為病害的科學防治和病菌的抗藥性監測提供重要科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

本實驗室自2007至2016年從陜西、山西和河南等省蘋果產區的田間發病植株采集分離了106株蘋果樹腐爛病菌，其中陜西省54株，山西省18株，新疆維吾爾自治區10株，河南省11株，遼寧省5株，山東省4株，四川省4株，用于敏感性測定。

1.1.2供試藥劑與濃度

95.6%苯醚甲環唑原藥，先正達公司提供;濃度設置為0.006 3、0.013、0.025、0.050、0.100和0.200 μg/mL。

1.2方法

1.2.1含藥培養基的制備

將苯醚甲環唑原藥溶于丙酮制成10 000 μg/mL母液，加入終濃度為0.2%的Tween80，置于4℃冰箱中備用。用蒸餾水稀釋母液，按設置濃度加入到PDA培養基中，充分混勻，配成不同質量濃度的苯醚甲環唑含藥平板。

1.2.2敏感性測定

參考Yin等[15]的方法進行。被測菌株于25℃條件下在PDA平板上培養72 h，利用打孔器自菌落邊緣打取大小相同、直徑為5 mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥平板的中心。每個濃度重復3次，以不加藥的PDA平板作為對照。25℃下培養72 h，用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計算不同濃度的苯醚甲環唑對菌絲的生長抑制率。

菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

以X（藥劑質量濃度的對數值）和Y（抑制率對應的幾率值）進行回歸分析得到毒力回歸方程Y=a+bX以及相關系數r，并計算EC50。

1.2.3數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0進行處理。對EC50進行KolmogorovSmirnov正態性檢驗，參照祁之秋等的方法[16]獲得蘋果樹腐爛病菌群體對苯醚甲環唑的敏感性頻率分布圖，建立對苯醚甲環唑的敏感基線。采用Duncan氏新復極差法對不同地區、不同年份的平均EC50進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感基線的建立

檢測發現，苯醚甲環唑對來自7個省的106株蘋果樹腐爛菌的EC50分布在0.003～0.123 μg/mL，平均值為（0.044±0.029）μg/mL。所檢測的菌株對該藥劑具有較高的敏感性，未發現抗藥性亞群體。但最大值為最小值的41倍，EC50跨度范圍比較大，表明群體內個體間對苯醚甲環唑的敏感性差異較大。

將本研究得到的EC50分成6個區間，每個區間出現的菌株頻率如圖1所示，EC50敏感性頻率呈現連續性單峰曲線分布，通過SPSS中的KS正態檢驗得到P=0.135>0.05，說明菌株對苯醚甲環唑的敏感性頻率符合正態分布，按照野生病原群體對藥劑的敏感性呈正態分布的原理，本研究中106株病菌的平均EC50（0.044 μg/mL±0.029 μg/mL）可作為蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感基線。

2.2不同地理來源的菌株對苯醚甲環唑的敏感性水平

不同地理來源的蘋果樹腐爛病菌菌株對苯醚甲環唑的敏感性存在一定的差異（表1），最敏感的是遼寧菌株，其EC50平均值為（0.020 0±0.008 8）μg/mL，最不敏感的是河南菌株，其EC50平均值為（0.059 6±0.023 6）μg/mL。山西、新疆、河南的菌株群體內部個體對苯醚甲環唑的敏感性差異較大。遼寧地區的菌株同河南、山東和新疆3個地區的菌株在P=0.05水平上差異顯著，其他地區的菌株對苯醚甲環唑的敏感性無顯著差異。

2.3不同年份的蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性水平

如表2所示，采自不同年份的蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性存在一定差異。2009年采集的菌株對苯醚甲環唑的敏感性最高，2016年菌株的敏感性最低，隨著年份推移病菌對苯醚甲環唑的敏感性逐漸減弱。

3討論

殺菌劑用于防治某種植物病害之前，建立其敏感基線有助于優化該殺菌劑的使用策略[17]。雖然苯醚甲環唑已經在生產上應用多年，但蘋果樹腐爛病菌對其敏感性水平尚不明確。本研究共檢測了采自中國7個省份的106株蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性。研究結果表明中國蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑還處于野生敏感種群階段，可將苯醚甲環唑對供試菌株的EC50平均值（0.044±0.029）μg/mL作為中國蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感基線。該敏感基線可用于監測田間蘋果樹腐爛病菌群體對苯醚甲環唑敏感性的變化，為評價其抗藥性風險和未來制定抗藥性治理策略提供參考。

本研究發現蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性差異與地理位置有關，這可能與不同地區的蘋果種植年限和面積、氣候環境條件、腐爛病的發生歷史，用藥措施以及病菌本身的遺傳差異及群體組成等因素有關[18]。此外，隨著時間的推移，蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性逐漸減弱，可能是由于生產中連續大量使用同類殺菌劑或者其他有交互抗性的殺菌劑，使得病菌對殺菌劑的敏感性發生了改變。為了延緩蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑抗藥性的產生，建議在田間通過輪換使用不同作用機制的藥劑，使蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環唑的敏感性處于低抗性頻率階段，以延長農藥的使用壽命。

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（責任編輯：楊明麗）