ALS抑制劑類除草劑的抗性研究概述

辛潔 徐小博 王磊 等

摘要 乙酰乳酸合成酶（ALS）是支鏈氨基酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是磺酰脲類除草劑的作用靶標(biāo)。針對(duì)目前市場(chǎng)上使用的4種ALS除草劑，對(duì)ALS抑制劑類除草劑的抗性雜草問題， ALS氨基酸序列中關(guān)鍵位點(diǎn)替換對(duì)ALS酶活性的影響與ALS基因編輯等方面的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

關(guān)鍵詞 乙酰乳酸合成酶;除草劑;抗性雜草;基因編輯

中圖分類號(hào) S482.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）04-0018-04

Abstract Acetolactate synthase （ALS） is a key enzyme in the branched chain amino acid biosynthesis pathway，and it is an important target for sulfonylurea herbicides.This article is a brief overview of study about ALS inhibitor herbicides and resistance weeds problem，including ALS inhibitor herbicides used in commercial，the problem of resistance weeds to ALS herbicides，the effect of ALS enzyme activity resulting from the ALS amino acids subsititution，and ALS gene editing.

Key words Acetylactate synthase;Herbicides;Resistance weeds;Gene editing

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS，EC 2.2.1.6）是催化支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。ALS酶只存在于植物和微生物體內(nèi)，如果采用ALS抑制劑對(duì)植物，包括農(nóng)作物進(jìn)行處理，不會(huì)影響食草動(dòng)物和人類體內(nèi)支鏈氨基酸的生物合成，因此ALS抑制劑的使用對(duì)動(dòng)物而言具有生物安全性[1]。酶活性的發(fā)揮與酶蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，對(duì)于ALS而言，其結(jié)構(gòu)的解析是深入研究和利用ALS的基礎(chǔ)。關(guān)于乙酰乳酸合成酶ALS的結(jié)構(gòu)研究，首先是在大腸桿菌（Escherichia coli）中進(jìn)行的，并且到目前為止，大腸桿菌ALS酶的結(jié)構(gòu)也是研究最為清楚的。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的ALS酶為四聚體，由2個(gè)大亞基和2個(gè)小亞基組成，大亞基的分子量約為60 kD，小亞基的分子量為10～20 kD[2-6]。

自從ALS酶的結(jié)構(gòu)開始解析以來，針對(duì)ALS酶為靶標(biāo)的除草劑的研發(fā)也如火如荼展開著。農(nóng)藥工作者先后開發(fā)出了不同系列的抑制劑，并成功推廣為商業(yè)化使用的除草劑。隨著除草劑的大量使用，特別是同一種除草劑的連續(xù)使用，雜草對(duì)某些抑制劑產(chǎn)生了抗性。為消除雜草，一些除草劑被加大劑量使用，尤其是殘留期較長(zhǎng)的除草劑的使用，對(duì)土壤質(zhì)地和農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)造成嚴(yán)重危害，近年來關(guān)于ALS除草劑的結(jié)構(gòu)、除草活性與抗性雜草問題的研究逐步深入，并取得了可喜的進(jìn)展。筆者概括了近年使用的幾種主要ALS除草劑及其抗藥性問題，同時(shí)圍繞ALS酶編碼基因介紹了基因編輯等方面的主要研究進(jìn)展。

1 ALS抑制劑類除草劑的作用和應(yīng)用

1.1 作用

ALS抑制劑類除草劑不僅對(duì)動(dòng)物具有生物安全性，而且該類除草劑的使用量顯著低于其他除草劑，具有廣譜除草、選擇性強(qiáng)、低毒高效、土壤殘留活性低的優(yōu)點(diǎn)[7]。現(xiàn)已開發(fā)出的ALS抑制劑類除草劑共有13類50余種，包括磺酰脲類（sulfonylureas，SU）[8-9]、嘧啶氧苯甲酸類（pyrimidinyloxy benzoic acids，PTB，又稱嘧啶水楊酸類）[10-11]、咪唑啉酮類（imidazolinones，IMI）[12]和三唑并嘧啶磺酰胺類（triazolopyrimidine sulfonanilides，SUT）[13]等主要類型[14]。它們的作用機(jī)制相同，都是通過抑制乙酰乳酸合成酶的活性，從而影響支鏈氨基酸和蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)停止而死亡。植物吸收上述4類除草劑的方式也相同，都通過莖葉和根吸收后在木質(zhì)部與韌皮部傳導(dǎo)進(jìn)行傳輸，最后積累于分生組織，即通過內(nèi)吸傳導(dǎo)作用進(jìn)行。

1.2 應(yīng)用 雖然這4類除草劑的作用和吸收方式相同，但是它們的結(jié)構(gòu)（圖1）[15]、作用雜草的種類、使用劑量、殘留期等有所不同（表1），因此，針對(duì)不同的作物需要有選擇地使用不同類型的ALS除草劑。

2 ALS抑制劑類除草劑的抗性雜草問題

生產(chǎn)實(shí)踐中ALS類除草劑的使用推廣極大地提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)量，減少了人力除草的成本，顯著增加了農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。但過度依賴單一除草劑（或作用位點(diǎn)相同的除草劑）可能導(dǎo)致對(duì)這種或這類除草劑有抗性的雜草種群出現(xiàn)[16]。特別是ALS抑制劑類除草劑，一直因其作用靶標(biāo)單一且易誘發(fā)雜草抗性而面臨著眾多問題。不同種類的ALS除草劑的應(yīng)用作物之間有一定的特異性，使得某些作物中的雜草只能長(zhǎng)期使用同種除草劑，這樣便導(dǎo)致ALS除草劑抗性雜草的快速發(fā)生。

1998年ALS抑制劑類除草劑在已被報(bào)道的抗性雜草數(shù)量方面超過了所有其他類除草劑（圖2）[17]。近年，ALS抑制劑類除草劑面臨的雜草抗性問題呈現(xiàn)進(jìn)一步惡化的趨勢(shì)。由表2可知（通過總結(jié)統(tǒng)計(jì)Weed Science網(wǎng)站http：∥www.weedscience.org/數(shù)據(jù)做圖），僅2016、2017年2年時(shí)間，便已發(fā)現(xiàn)有22例ALS抗性雜草情況的發(fā)生。因此亟需對(duì)ALS抑制劑類除草劑的抗性問題展開深入研究。

3 ALS基因中突變位點(diǎn)的研究

Lawther等[18]首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并克隆到了ALS基因。Falco等[19]在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中也發(fā)現(xiàn)并克隆到了ALS基因。截至目前，借助于擬南芥和煙草的基因組文庫信息，相繼篩選到了多種植物的ALS基因[20-21]。其中擬南芥ALS基因的發(fā)現(xiàn)和克隆有著重要的意義，其為人們發(fā)掘植物，特別是農(nóng)作物的ALS基因提供了重要的信息。Wiersma等[22]發(fā)現(xiàn)蕓苔屬的多個(gè)種具有ALS基因，且發(fā)現(xiàn)該物種存在4個(gè)以上的ALS基因。李汝剛等[23]研究也發(fā)現(xiàn)ALS基因在蕓苔屬亞種間和品種間存在廣泛的遺傳變異性。

磺酰脲類Sultonylureas磺酰脲橋結(jié)構(gòu)是具備較高活性的決定因素4～701年生或多年生闊葉雜草及部分禾本科氯磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆、氯嘧磺隆、單嘧磺隆殘效期長(zhǎng)可化學(xué)水解、微生物降解、光解或揮發(fā)無傷害（除殘效期長(zhǎng)品種外）

4 ALS基因編輯研究

由上所述可知，抗性雜草ALS基因位點(diǎn)的突變是引起抗性的分子基礎(chǔ)，意味著通過ALS基因的優(yōu)化有望解決抗性雜草問題。近年來不同研究組證實(shí)ALS酶中氨基酸序列的替換是解決ALS抑制劑類除草劑抗性雜草多發(fā)問題的策略。如許多課題組針對(duì)ALS氨基酸替換展開研究，包括單點(diǎn)突變和多點(diǎn)同時(shí)突變等，以期解決抗性雜草帶來的作物減產(chǎn)等嚴(yán)重問題。有的通過利用雜草產(chǎn)生的自然突變位點(diǎn)來培育抗性作物，更多的是采用基因編輯技術(shù)對(duì)ALS基因進(jìn)行點(diǎn)突變以獲得抗性作物。

綜合近年對(duì)ALS氨基酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，大多研究是針對(duì)ALS氨基酸序列中高發(fā)生突變位點(diǎn)進(jìn)行編輯。研究最多是針對(duì)雜草中197位的Pro突變，作物中Pro位點(diǎn)的突變能使其產(chǎn)生磺酰脲類除草劑抗性。如2015年，有報(bào)道顯示利用Cas9的基因編輯技術(shù)對(duì)玉米的ALS基因進(jìn)行了點(diǎn)突變處理，用Ser替換了165位的Pro，培育出了抗除草劑（氯磺隆）的基因編輯玉米。轉(zhuǎn)基因株系的除草劑處理顯示，無論是對(duì)4周齡的幼苗進(jìn)行氯磺隆噴灑，還是在培養(yǎng)玉米種子的培養(yǎng)基中直接添加氯磺隆，未做編輯的野生型已經(jīng)出現(xiàn)葉片黃化、植株矮小萎蔫的生長(zhǎng)狀況，而經(jīng)編輯的株系生長(zhǎng)正常[26]。2017年，Chen等[27]在擬南芥中，利用傳統(tǒng)Cas9系統(tǒng)結(jié)合胞苷脫氨酶BE3使197位Pro的C堿基變?yōu)門堿基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用5 mg/L苯磺隆處理的情況下，野生型完全無法生長(zhǎng)而突變株生長(zhǎng)狀況與無處理的對(duì)照組差異很小。2018年，北京市農(nóng)林科學(xué)院國家蔬菜工程技術(shù)中心許勇研究團(tuán)隊(duì)與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)姜臨建課題組合作利用CRISPR/Cas9單堿基編輯技術(shù)在西瓜內(nèi)源ALS基因上引入了單堿基突變，使190位的Pro被Ser替換，創(chuàng)制出全球首個(gè)基因編輯抗除草劑（苯磺隆）的西瓜[28]。

另外，也有針對(duì)其他熱點(diǎn)的單突變，如雜草中122位的Ala突變能使作物產(chǎn)生磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑抗性。2018年Zenpei Shimatani課題組將水稻中96位（雜草中為122位）Ala替換為Val，并在0.07 mg/L甲氧咪草煙處理?xiàng)l件下相對(duì)野生型就已表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[29]。

除上述單位點(diǎn)突變，還有雙位點(diǎn)突變成功的報(bào)道。如雜草中574位的Trp突變能使作物產(chǎn)生對(duì)磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的抗性，雜草中653位的Ser突變能使作物產(chǎn)生對(duì)咪唑啉酮類除草劑的抗性，而多位點(diǎn)突變可能會(huì)產(chǎn)生交互抗性或新的除草劑抗性。2016年報(bào)道以Cas9技術(shù)對(duì)水稻ALS基因進(jìn)行突變處理，分別將548位（雜草中為574位）Trp和627位（雜草中為653位）Ser 替換為L(zhǎng)er和Ile，培育出了抗雙草醚的基因編輯水稻。使用雙草醚噴灑處理五葉期基因編輯水稻和野生型水稻，結(jié)果顯示野生型葉片黃化、植株矮小萎蔫十分嚴(yán)重，而經(jīng)編輯的株系生長(zhǎng)正常[30]。

5 展望

綜上所述，盡管使用ALS除草劑是非常有效的雜草清理方法，但是由于不同種類ALS除草劑對(duì)不同作物的作用效果有較大差異，大部分作物只能依賴特定或某幾種除草劑來清除雜草，這種長(zhǎng)期過度依賴單一或一類除草劑導(dǎo)致抗性雜草種群的出現(xiàn)。針對(duì)ALS抗性雜草嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)及產(chǎn)量的問題已經(jīng)引起農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域相關(guān)學(xué)科的極大關(guān)注，而且在未來幾年，仍將是研究熱點(diǎn)。一方面亟需設(shè)計(jì)合成，或通過對(duì)已有除草劑的修飾來開發(fā)綠色環(huán)保的新型ALS除草劑;另一方面，ALS基因的編輯有望成為解決ALS抗性雜草問題的重要途徑之一。筆者所在的課題組近年也在采用基因編輯技術(shù)，對(duì)ALS基因進(jìn)行點(diǎn)突變。以模式植物擬南芥為材料，進(jìn)行改造后ALS基因的遺傳轉(zhuǎn)化，以探究ALS基因中特定編碼氨基酸的替換是否能使擬南芥獲得目的除草劑抗性，目前已經(jīng)獲得數(shù)個(gè)具有特定除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱振興，李丹，王春雨.利用玉米乙酰乳酸合成酶基因 ALS 點(diǎn)突變處理培育抗除草劑高粱[J].分子植物育種，2017，15（11）：4563-4572.

[2] EOYANG L， SLIVERMAN P M.Purification and subumit composition of aeetohydroxyacid synthaseⅠfrom Esehierchia coli K12[J].Jounal of Bacteriology，1984（157）：184-189.

[3] LAWTHER R P， CALHOUN D H.Molecular basis of valine resistance in Esehierchia coli K12[J].Proeeeding of Natural Academie Science USA， 1982（78）：922-925.