包埋法制備替米考星淀粉微球工藝的優化

王麗 陳洪軒 常杰等

摘要 [目的]研究替米考星淀粉微球的制備工藝。[方法]以可溶性淀粉為原料，以N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，以過硫酸鉀和亞硫酸氫鈉為引發劑，采用包埋法制備替米考星淀粉微球。以載藥量和包封率為指標，通過正交試驗，采用綜合平衡法對替米考星淀粉微球的制備工藝進行優化，在掃描電子顯微鏡下觀察替米考星交聯微球的形貌及表面形態。[結果]替米考星淀粉微球的最佳制備工藝如下：替米考星0.02 g，可溶性淀粉4 g，交聯劑（N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）0.95 g，乳化劑（mSpan80：mTween80=2∶1）0.75 g，反應時間1.5 h，在優化工藝參數下制得的替米考星淀粉微球載藥量為1.63%，包封率為81.4%;微球大小分布均勻，外觀圓整，表面粗糙多孔。[結論]該制備工藝可行，擴大了替米考星的應用，為替米考星的劑型改進提供了參考。

關鍵詞 替米考星;可溶性淀粉;包埋法;微球制備工藝

中圖分類號 S859.79+6文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0110-04

Abstract [Objective] To study the preparation process of tilmicosin starch microspheres.[Method] With soluble starch as materials，N，Nmethylenebisacrylamide as crosslinking agent and potassium persulfate with sodiun bisulflte as initiator，tilmicosin starch microsphere was synthesized by using embedding method.The preparation process of tilmicosin starch microsphere was optimized by integrated balance method through the orthogonal experiment，with the drug loading and encapsulation rate as indicators.The morphology features and surface topography of tilmicosin starch microsphere were characterized by Quanta 250FEG scanning electron microscope.[Result]The optimum preparation process was as follows：the quantity of tilmicosin 0.02 g，soluble starch 4.0 g，N，Nmethylenebisacrylamide 0.95 g，surfactant （mSpan80∶mTween80=2∶1）0.75 g， and the reaction time was 1.5 h.Under these optimized technology parameters，the drug loading and embedding ratio of tilmicosin starch microsphere were ?1.63% and 81.4% respectively.The size of microspheres was uniform，the appearance was round and the surface was rough and porous.[Conclusion] The ?preparation process was feasible，which expanded the application of tilmicosin.Therefore this research provided references for the improvement of tilmicosins dosage forms .

Key words Tilmicosin;Soluble starch; Embedding method;Preparation process of microspheres

替米考星是一種以泰樂菌素為前體藥物半合成而來的畜禽專用抗生素[1]，20世紀80年代由英國Elanco公司開發。替米考星具有很強的抗菌活性，抗菌譜廣，耐藥性低，對所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、霉形體、螺旋體等均有抑制作用，臨床上主要用于預防和治療豬、雞、牛、羊等由細菌和支原體感染引起的疾病，如豬喘氣病、乳房炎、雞慢性呼吸道病、胸膜炎等[2]。目前，替米考星已在許多國家批準上市，我國現有劑型主要有預混劑、注射液、飲水劑，但現有劑型給藥后會表現出明顯的峰谷現象，且產生心臟毒性和腎臟毒性的可能性較大，使不良反應率大大增加[3-4]。微球具有緩釋與長效性、掩蓋藥物不良氣味、提高藥物穩定性、低毒、無免疫原性等特點[5-6]。以無毒、安全、原料廉價易得的可溶性淀粉為原料制備的微球是一種理想的新型藥物載體，具有較好的生物可降解性、生物相容性、生物穩定性和較低的毒性[7-8]。筆者以可溶性淀粉為原料，采用包埋法[9]制備替米考星淀粉微球，并對其制備工藝進行優化，以期獲得最佳制備工藝，擴大其臨床應用范圍。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥物 替米考星（遼寧大連鑫輝生物科技有限公司，批號為20140402）、可溶性淀粉（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20160922）、環己烷（天津市永大化學試劑有限公司，批號為20140308）、司班80（上海化學試劑有限公司，批號為20140812）、吐溫80（天津市富宇精細化工有限公司，批號為20120720）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20171012）、無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司，批號為20160801）、乙酸乙酯（天津市永大化學試劑有限公司，批號為20161001）、過硫酸鉀（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20150710）、亞硫酸氫鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20161210）、氫氧化鈉（天津市凱通化學試劑有限公司，批號為20081018）。試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 紫外分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司）、場發射掃描電鏡（Quanta 250FEG，美國FEI）、集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鄭州長盛實驗設備器有限公司）、循環水式多用真空泵（SHB-ⅢA，鄭州長城科工貿有限公司）、超聲波清洗器（KQ2200E，昆山市超聲儀器有限公司）、電子天平（WT5003CH，常州萬泰天平儀器有限公司）。

1.3 淀粉微球的制備

1.3.1 空白淀粉微球的制備。

1.3.1.1 油相的制備。將80 mL環己烷置于250 mL錐形瓶中，加入司班80和吐溫80（按質量比2∶1加入），在50 ℃水浴條件下，攪拌溶解，備用。

1.3.1.2 水相的制備。將4 g可溶性淀粉置于100 mL燒杯中，加入30 mL純化水，在80 ℃水浴條件下，使其溶解;用氫氧化鈉溶液調節pH 9～10;轉移至60 ℃恒溫水浴鍋中，加入0.6 g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺和0.6 g過硫酸鉀，攪拌溶解，備用。

1.3.1.3 空白微球的制備。將油相加入到水相中，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃下攪拌使其乳化0.5 h，加入0.6 g亞硫酸氫鈉，升溫至60 ℃，引發交聯反應，攪拌反應2 h，靜置，取下層沉淀，用適量乙酸乙酯洗滌多次，再用適量無水乙醇洗滌多次，抽濾，干燥，得到空白淀粉微球。

1.3.2 替米考星淀粉微球的制備。使用以下成分制備替米考量淀粉微球：替米考星0.02 g、環己烷80 mL、 司班80∶吐溫80（質量比為2∶1）0.75 g、可溶性淀粉4 g、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺0.95 g、過硫酸鉀0.6 g、亞硫酸氫鈉0.6 g、蒸餾水30 mL。

1.3.2.1 油相的制備。將80 mL環己烷置于250 mL錐形瓶中，加入司班80和吐溫80（按質量比2∶1加入），在50 ℃水浴條件下，攪拌溶解，待用。

1.3.2.2 水相的制備。將4 g可溶性淀粉置于100 mL燒杯中，加入30 mL純化水，在80 ℃水浴條件下，使其溶解;降溫至60 ?℃，加入0.02 g替米考星、0.95 g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺和0.6 g過硫酸鉀，攪拌溶解，備用。

1.3.2.3 替米考星淀粉微球的制備。將油相加入到水相中，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃下攪拌使其乳化0.5 h，加入0.6 g亞硫酸氫鈉，升溫至60 ℃，引發交聯反應，攪拌反應2 h，靜置后取下層沉淀，用適量乙酸乙酯洗滌多次，再用適量無水乙醇洗滌多次，抽濾并干燥，得到替米考星淀粉微球。

1.4 替米考星標準曲線的繪制

稱取替米考星0.011 3 g置于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容，為儲備液。分別從上述儲備液中一起移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻。在紫外可見分光光度計下于最大吸收波長282 nm[10]處測定吸光度，繪制替米考星的標準曲線。

1.5 單因素試驗

為了考察影響替米考星淀粉微球的載藥量和包封率的因素，根據替米考星淀粉微球的制備方法，控制其他因素和條件不變，分別以替米考星的用量、反應時間、交聯劑的用量、乳化劑的用量為研究對象進行單因素試驗。

1.6 正交試驗

為了確定替米考星淀粉微球的最佳制備工藝，在單因素試驗結果及有關報道的基礎上[11]，選定替米考星用量（A）、反應時間（B）、交聯劑用量（C）、乳化劑用量（D）為影響因素，每個因素選取3個水平（表1），進行正交試驗設計。

1.7 評價指標

每次取0.1 g替米考星淀粉微球，加入定量的無水乙醇，超聲一定時間，過濾后取濾液，用無水乙醇定容至50 mL，在紫外分光光度計下測其吸光度，帶入標準曲線計算替米考星濃度，最后計算其載藥量（Y1）和包封率（Y2）。

1.8 替米考星交聯淀粉微球的表征

取一定量的替米考星淀粉微球真空冷凍干燥后噴金制樣，在Quanta 250FEG掃描電子顯微鏡下觀察其形貌及表面形態[12]。

2 結果與分析

2.1 替米考星的標準曲線

由圖1可知，替米考星的標準曲線回歸方程為：y=0.036 2x+0.000 2（R2=0.999 9），在濃度0.005～0.050 mg/mL范圍內有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 替米考星用量對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”的試驗方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察替米考星用量為0.02、0.05、0.10和0.15 g 時對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結果見圖2。

2.2.2 反應時間對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”中試驗方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察反應時間為1.0、1.5、2.0、2.5 h時對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結果見圖3。

2.2.3 交聯劑用量對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”中試驗方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察交聯劑用量為0.85、0.90、0.95、1.00 g時對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結果見圖4。

2.2.4 乳化劑用量對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響。按照“1.3”中試驗方法，控制處方及制備工藝中其他條件不變，分別考察乳化劑用量為0.60、0.75、0.90和1.05 g時對替米考星淀粉微球載藥量和包封率的影響，結果見圖5。

2.3 正交試驗結果

根據正交試驗因素與水平表（表1），以載藥量（Y1）和包封率（Y2）為考察指標進行正交試驗，結果見表2～3。

以載藥量（Y1）和包封率（Y2）為考察指標，在正交試驗結果分析時使每個指標盡可能達到最優。采用綜合平衡法[13]的統計學分析方法，先對每個指標分別進行單指標的直觀分析，得到每個指標的影響因素主次順序和最佳水平組合：①以載藥量為考察指標時，影響因素從大到小依次為交聯劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應時間，最佳制備工藝條件為A1B2C3D2（表2）。②以包封率為考察指標時，影響因素從大到小依次為交聯劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應時間，最佳制備工藝條件為A1B2C3D2（表3）。

根據理論知識和實際經驗，交聯劑用量要適當，當交聯劑用量為1.00 g時，雖然載藥量和包封率較高，但通過掃描電鏡的觀測發現微球少，且大量粘連，因此選擇的交聯劑用量為0.95 g，即C2。

綜合考慮Y1和Y2 2個指標后，確定各影響因素從大到小依次為交聯劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應時間;最佳制備工藝條件為A1B2C2D2，即替米考星0.02 g，交聯劑0.95 g，乳化劑0.75 g，反應時間1.5 h，按照優化工藝參數制得的替米考星淀粉微球的載藥量為1.63%，包封率為81.4%。

2.4 替米考星交聯淀粉微球的表面形態分析 由圖6可知，微球形貌較圓整規則，大小比較均一。微球表面粗糙多孔，無粘連。這說明反應過程中交聯乳化效果較好，體系較為穩定。

3 討論

（1）制備過程中應注意集熱式恒溫加熱磁力攪拌器的攪拌速度。攪拌速度過小，水相易粘連成塊狀，交聯效果差;攪拌速度過大，油相易飛濺，影響反應的進行。因此，在反應過程中需要適當控制攪拌速度，且用錐形瓶作為反應器，以減少油相的飛濺。

（2）采用適當的兩相加入的方法。文獻中均采用水相加入油相的制備方法，但經過多次預試驗發現，由于水相為可溶性淀粉溶液，較為黏稠，在制備過程中損失較大，因此該研究采用油相加入水相的方法，易于操作，減少了藥物損失，提高了包封率和載藥量。

（3）洗滌微球應充分。用適量乙酸乙酯洗滌多次，再用適量無水乙醇洗滌多次;否則，抽濾后的微球粘成塊狀，不易干燥，且不易破壞，影響含量的測定。

4 結論

采用單因素試驗和正交試驗優化替米考星淀粉微球的制備工藝，各影響因素從大到小依次為交聯劑用量、替米考星用量、乳化劑用量、反應時間;最佳制備工藝條件如下：替米考星0.02 g，交聯劑0.95 g，乳化劑0.75 g，反應時間1.5 h，按照此優化工藝參數制得的替米考星淀粉微球載藥量為1.63%，包封率為81.4%;制得的微球形貌較為圓整規則，大小較為均一。該研究為替米考星劑型的改進和創新提供了新思路，擴大了替米考星的應用范圍，也為獸藥新劑型和新技術的研究與發展提供了重要參考。

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