新疆藥桑總黃酮的富集純化工藝研究

何倩 蘇比努爾 李俊輝 等

摘要 [目的]通過對大孔樹脂的篩選和單因素考察，對藥桑總黃酮純化富集工藝進行優化。[方法]選擇靜態吸附-解吸試驗篩選純化藥桑總黃酮的大孔樹脂型號，采用紫外法測定總黃酮含量。進一步根據上樣液流速、上樣液質量濃度、pH、洗脫劑用量及洗脫劑流速確定最優富集工藝;采用高效液相色譜法進行主要成分檢測，從而對單體成分含量進行控制。[結果]AB-8型大孔樹脂對藥桑黃酮的吸附與洗脫性能較好，最優純化條件為藥液濃度0.208 mg/mL、pH 4、上樣液流速1.5 mL/min，再用70%乙醇溶液40 mL進行洗脫。[結論]AB-8型大孔樹脂可有效富集、純化藥桑總黃酮，通過HPLC進行質量監控可保證純化工藝穩定可行。

關鍵詞 藥桑;總黃酮;大孔樹脂;富集;純化工藝

中圖分類號 R284.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0176-05

藥桑在植物學分類上屬桑科（Moraceac）桑屬（Morus L.）黑桑種（Morus nigra Linn.）[1]，是植物藥桑樹的成熟果穗，集中分布在新疆阿克蘇、和田、喀什等地區，也是新疆傳統民間藥材[2]，《本草綱目》中記載“桑果實常用可起活血補腦、通脈護肝、強生健體、強腎利尿、降壓降脂、解酒護肝的作用，可治麻疹、水痘、咽炎、氣管炎、口舌生瘡、牙周炎等疾病”。現代醫學研究表明，新疆藥桑具有提高人體免疫力、降血壓、降血脂、降血糖、美顏抗衰老等作用[3-5]，是珍貴的藥食兩用資源。

現今，隨著國內外對藥桑藥用價值及藥理活性的研究深入，發現藥桑中含有多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等活性成分[6-7]。傅大煦[1]對新疆桑椹的抗高血壓活性篩選中發現其有效部位為花色苷等黃酮類成分，認為其作用主要與黃酮類化合物的抗氧化作用有關。因此黃酮類組分可能是藥桑發揮藥理作用的重要活性物質，但關于藥桑黃酮類物質的分離純化技術鮮見報道，這直接影響到后續藥桑產品的開發成本及質量。筆者對藥桑中總黃酮化合物的提取及純化工藝進行研究，選用5種不同物理和化學性能的大孔樹脂，以樹脂的靜態吸附量和解吸率為考察指標，確定適宜純化藥桑總黃酮的樹脂類型;然后依次考察樹脂吸附因素（吸附液pH、上樣量及濃度、流速）對藥桑總黃酮吸附量的影響，通過考察洗脫液體積及流速評價樹脂對藥桑黃酮的洗脫能力，采用高效液相色譜法對經過最佳吸附條件進行富集的藥桑黃酮進行質量控制，最終確定最佳富集條件。

1 材料與方法

1.1 材料 新疆藥桑（Morus nigra Linn.），采集成熟期藥桑，由新疆醫科大學中藥教研室徐海燕副教授鑒定為桑科黑桑種。無水乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，天津市致遠化學試劑有限公司;甲醇，天津永晟精細化工有限公司;AB-8、D-101、LX-17、LX-30、LSA-12型大孔樹脂，西安藍曉科技有限公司;蘆丁對照品、槲皮素對照品、白藜蘆醇對照品、綠原酸對照品，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器 UV-2700紫外-可見分光光度計（日本島津）;Waters e2695高效液相色譜儀（美國waters）;R1001-VN 旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）;KQ3200DE電熱恒溫水浴鍋（昆山市超聲儀器有限公司）;TDL-5A 離心機（上海江儀儀器有限公司）;恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥桑總黃酮的提取及含量測定。稱取干燥處理、過40目篩的藥桑粉末約2.0 g置于圓底燒瓶，加入70%乙醇80 mL，在80 ℃水浴下回流提取2次，每次60 min，合并濾液濃縮至1/2體積。濾過置100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到藥桑總黃酮粗提液備用。

1.3.1.1 蘆丁標準曲線繪制。精密稱取烘干至恒重的蘆丁對品5 mg，用60%乙醇溶解，定容到25 mL，配成0.2 mg/mL的蘆丁對照溶液，準確量取0、1、2、3、4、5 mL的對照品儲備溶液分別置于10 mL容量瓶中，各加入60%乙醇至5 mL，再依次加入濃度為5%的NaNO2 溶液 0.3 mL搖勻，放置6 min， 后加入濃度為10%的 Al（NO3）3溶液0.3 mL，放置6 min，然后加入4%的 NaOH溶液4 mL，放置15 min，60%乙醇定容至10 mL。在波長為505 nm下測吸光度（A）。以吸光度（A）為橫坐標、蘆丁質量濃度（mg/mL）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.1.2 藥桑總黃酮含量測定。精密吸取總黃酮提取液2 mL 置于25 mL具塞試管中，加入3 mL乙醇搖勻，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液搖勻靜置6 min，加入4 mL 4% NaOH溶液后搖勻靜置15 min，加入0.4 mL乙醇溶液使具塞試管中液體總體積為10 mL。在505 nm處測定吸光度值，然后按照標準曲線法計算藥桑總黃酮的含量。總黃酮含量（mg/g）=（Y×V）/W、總黃酮提取率=（Y×V）/（W×103）×100%，其中，Y為根據標準曲線方程計算出的藥桑總黃酮的質量濃度（mg/mL）;V為原浸提液體積（mL）;W為提取用的藥桑粉末的質量（g）。

1.3.2 藥桑總黃酮的純化。

1.3.2.1 大孔吸附樹脂預處理。將5種不同型號樹脂（AB-8、D-101、LX-17、LX-30、LSA-12）在95%乙醇中浸泡24 h，隔段時間用玻璃棒攪拌，使得樹脂和乙醇充分接觸并趕走空氣，濕法裝柱用蒸餾水洗滌至中性;然后加入5%的HCl溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性;最后加入5% NaOH溶液浸泡12 h后，用蒸餾水洗至中性，備用。

1.3.2.2 靜態吸附試驗及相關指標的計算。準確量取15 mL已預處理好的5種不同型號的大孔吸附樹脂置于錐形瓶中，各加入40 mL藥桑粗提液，置于搖床上振蕩24 h，過濾取過濾液測定其中總黃酮的質量濃度，計算吸附量、吸附率。再將已吸附的大孔樹脂置于錐形瓶，再加入70%乙醇40 mL置于25 ℃恒溫振蕩器振蕩2 h，過濾測定解吸液中總黃酮含量，計算解吸率。靜態吸附量=（吸附前樣品總黃酮含量-吸附后濾液總黃酮含量）/樹脂體積、解吸率=解吸液總黃酮含量/（吸附前樣品總黃酮含量-吸附后濾液總黃酮含量）×100%。

1.3.2.3 藥桑總黃酮對AB-8樹脂吸附及解吸的影響。根據靜態吸附試驗相關指標的計算，該試驗確定了AB-8大孔樹脂對藥桑黃酮組分吸附效果最好，因此進一步采用動態法比較AB-8大孔樹脂對藥桑黃酮成分的最佳上樣濃度、上樣流速、上樣液pH以及洗脫劑濃度、洗脫體積對目標成分的富集分離最佳條件。

（1）樣品液質量濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響。用靜態吸附試驗中吸附能力最強的AB-8大孔吸附樹脂，分別飽和吸附質量濃度為0.084、0.125、0.167、0.208、0.252 mg/mL體積為60 mL、pH為4的藥桑黃酮提取液，根據其吸附量計算樹脂對藥桑黃酮的吸附率，確定上樣液的最佳質量濃度。

（2）上樣液流速對AB-8樹脂吸附效果的影響。取pH為4、質量濃度為0.208 mg/mL藥桑黃酮提取液60 mL，分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速通過AB-8大孔吸附樹脂，準確測定藥桑黃酮質量濃度，根據吸附率選擇最佳上樣流速。

（3）上樣液pH對AB-8樹脂吸附效果的影響。取質量濃度0.208 mg/mL藥桑黃酮提取液60 mL，以1.5 mL/min的流速通過AB-8大孔樹脂，通過柱體時調節藥桑溶液pH分別為1、2、3、4、5，根據吸附率選擇最佳的上樣液pH。

（4）洗脫劑濃度對AB-8樹脂解吸藥桑總黃酮效果的影響。取質量濃度0.208 mg/mL、pH調節為4的藥桑黃酮提取液60 mL，以1.5 mL/min的流速通過AB-8大孔樹脂，選擇10%、30%、50%、70%、90% 5種不同體積分數的乙醇溶液兩倍柱體積下洗脫，根據解吸率選擇最佳洗脫劑濃度。

（5）洗脫劑用量對AB-8樹脂解吸藥桑總黃酮效果的影響。取質量濃度0.208 mg/mL、pH調節為4的藥桑黃酮提取液60 mL，以1.5 mL/min的流速通過AB-8大孔樹脂，選擇20、40、60、80和100 mL的70%乙醇溶液進行過柱洗脫，根據解吸率選擇最佳洗脫劑用量。

1.3.3 高效液相色譜法驗證富集純化工藝。

1.3.3.1 色譜條件。色譜柱：大連伊力特C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1 %甲酸（B）;梯度洗脫程序：0～40 min，20%A～80%A;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;檢測波長335 nm。

1.3.3.2 對照品的制備。精密稱取對照品蘆丁9.87 mg、槲皮素11.80 mg、綠原酸10.01 mg、白藜蘆醇9.96 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度作為對照品儲備液;精密吸取一定比例的對照品儲備液，混合均勻后制得蘆丁20 μg/mL、槲皮素0.06 μg/mL、綠原酸15.50 μg/mL、白藜蘆醇1.18 μg/mL的混標溶液，在水浴鍋上蒸干備用。

1.3.3.3 供試品的制備。在“1.3.3.2”試驗基礎上，精密稱取藥桑提取液烘干后的粉末10.11 mg，置于10 mL容量瓶中，在超聲條件下用甲醇溶解定容，在水浴鍋上蒸干備用。

1.3.3.4 方法學考察。

（1）專屬性。按“1.3.2.1”色譜條件進樣，得到對照品溶液和藥桑提取供試品樣液HPLC色譜圖，根據圖譜各峰保留時間等考察試驗專屬性。

（2）線性關系。吸取對照品儲備液1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 mL 至10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容制備成一系列對照品溶液。按“1.3.2.1”色譜條件進行測定，并記錄峰面積，以峰面積對對照品濃度進行線性回歸，計算回歸方程。

（3）精密度。精密吸取綠原酸、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素濃度分別為4.5、10.0、0.3、0.046 μg/mL的混合對照品溶液1 mL，按“1.3.2.1”色譜條件重復進樣5次，記錄峰面積，計算RSD值考察儀器精密度。

（4）重復性。精密稱取藥桑過注后烘干粉末50 mg，用甲醇稀釋定容至10 mL容量瓶，按“1.3.2.1”色譜條件進樣，重復以上操作5次，記錄峰面積并計算含量，計算RSD值考察方法的重復性。

（5）穩定性。取同一供試品溶液，分別在0、1、4、8、24 h時按“1.3.2.1”的色譜條件測定，記錄峰面積，計算RSD值考察樣品穩定性。

（6）加樣回收試驗。精密稱取已知藥桑粉末50 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容并在100 W超聲條件下超聲10 min，吸取已知濃度的混標溶液并加入。按照“1.3.2.1”色譜條件進樣，計算各對照品加樣回收率及RSD值。

1.3.3.5 樣品測定。分別精密稱取過柱前、后藥桑粉末約50 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容并在100 W超聲條件下超聲10 min。按照“1.3.2.1”色譜條件進樣，計算各成分純度。

2 結果與分析

2.1 藥桑總黃酮含量的測定 以蘆丁為標準品，按“1.3.1.2”操作得到其吸光度，最終得回歸方程Y=11.831 4x-6.19×10-4（R2=0.999 7），表明蘆丁在0～1 mg/mL 呈良好線性關系。

在505 nm處測定吸光度，然后按照標準曲線法計算藥桑總黃酮的含量為20.46 mg/g，RSD=1.08%（n=3），提取率為10.18%，RSD=1.58%（n=3）。

2.2 藥桑總黃酮的富集純化

2.2.1 樹脂的篩選。5種大孔吸附樹脂對藥桑總黃酮的吸附、解吸性能見表1。由表1可知，AB-8和D-101的靜態吸附量和吸附率均高于其他型號樹脂，而AB-8的解析量和解吸率較其他型號樹脂高，綜合考慮吸附和解吸能力，確定此次試驗選用AB-8 型大孔樹脂純化藥桑總黃酮。

2.2.2 藥桑總黃酮對AB-8樹脂吸附及解吸的影響。

2.2.2.1 樣品液質量濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響。從圖1可以看出，當上樣液濃度在0.084～0.208 mg/mL時，樹脂的吸附率隨著上樣液濃度增加而提高，隨著濃度進一步增大，吸附率反而呈降低的趨勢。其原因可能為高濃度的上樣液會使得黃酮組分超載導致通過柱床的速度減慢，不能被及時吸附，因此選擇上樣液的質量濃度0.208 mg/mL。

2.2.2.2 上樣液流速對AB-8樹脂吸附效果的影響。從圖2可以看出，上樣液的流速對藥桑總黃酮吸附率的影響較大。當流速為1.5 mL/min時，其吸附率達到最大，隨著繼續增大，吸附率呈下降趨勢。因此最佳的上樣流速為1.5 mL/min。

2.2.2.3 上樣液pH對AB-8樹脂吸附效果的影響。從圖3可以看出，當pH為4時，其吸附率達到最大，隨著pH的繼續增大，吸附率呈下降趨勢。因此最佳的上樣液pH為4。

2.2.2.4 洗脫劑濃度對AB-8樹脂解吸藥桑總黃酮效果的影響。從圖4可以看出，供試液經過AB-8大孔樹脂純化后，30%、50%和70%乙醇洗脫部分解吸率較高。洗脫液濃度低于30%時，一些極性大的雜質類化合物被洗脫，造成固形物的得率高，但總黃酮的純度低，最終選用70%乙醇溶液洗脫。

2.2.2.5 洗脫劑用量對AB-8樹脂解吸藥桑總黃酮效果的影響。從圖5可以看出，洗脫劑用量對藥桑總黃酮解吸率的影響較小。洗脫劑用量在40 mL以下時，隨著洗脫劑用量的增大，對AB-8樹脂的解吸率明顯增大;洗脫劑用量在40 mL以上時，解吸率增大緩慢。可見，40 mL洗脫液較穩定。

2.3 高效液相色譜法驗證富集純化工藝

2.3.1 專屬性考察。從圖6可以看出，綠原酸、蘆丁、槲皮素分離度良好。

2.3.2 方法學考察。由表3可見，綠原酸、蘆丁、槲皮素3種對照品在質量濃度為0.059～20.000 μg/mL線性關系良好。精密度試驗中，3種對照品的精密度RSD分別為1.92%、3.34%、1.47%。24 h 穩定性試驗中，綠原酸、蘆丁、槲皮素的RSD分別為0.890%、0.826%、2.520%，表明供試品溶液在24 h內穩定。重復性試驗中RSD分別為1.18%、0.75%、2.10%，表明方法重復性良好。高、中、低不同濃度的平均回收率為89%～103%，RSD均小于2%符合相關要求。

2.3.3 樣品含量測定。按照“1.3.3.5”操作，結果發現，通過HPLC法確定純化后的藥桑提取物中含有綠原酸、蘆丁、槲皮素3種成分（圖7），其含量分別為1.36、2.54、0.01 μg/mg。

3 討論

新疆藥桑為特色藥材，在南疆地區廣有種植，但由于其成熟期較短往往造成大面積的資源浪費，目前市場上也鮮有相關產品。為了更好地開發利用這一特色藥食兩用資源，在前期的基礎性研究中通過網絡藥理學技術篩選出藥桑抗糖尿病的多靶標及活性成分，初步發現，藥桑中的槲皮素、白藜蘆醇、桑色素等可能是藥桑發揮抗糖尿病作用的主要成分，這些都屬于黃酮類成分[8]。有報道認為，藥桑黃酮不僅具有良好的抗氧化活性，而且對糖尿病大鼠具有較好的降血糖、降血脂作用[9]。進一步的作用靶點研究發現，活性成分的高頻作用靶點可能與氮代謝、半乳糖代謝、PI3K-Akt信號通路等密切相關，這些作用通路可能是藥桑發揮多組分協同防治糖尿病的活性依據。為了更加深入地研究藥桑黃酮抗糖尿病的作用機制，有必要對其黃酮類藥效物質進行進一步的分離純化。

大孔樹脂是目前工業上富集、純化黃酮和皂苷類最為常用的高分子化合物[10-12]。該試驗選擇5種不同型號與類型的大孔樹脂，通過靜態吸附-解吸試驗，利用紫外的NaNO2法對藥桑中黃酮含量進行測定，比較確定AB-8型大孔樹脂作為純化藥桑總黃酮的最優樹脂。進一步通過因素考察確定了最佳純化工藝：藥液濃度約為0.208 mg/mL、pH為4、上樣液流速1.5 mL/min，再用70%乙醇溶液40 mL進行洗脫，非常適用于藥桑總黃酮的工業化制備。

該試驗考慮僅僅以紫外法作為總黃酮含量的測定方法不夠準確，因為藥桑總黃酮中的主要成分除了蘆丁外，還含有綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、桑色素等[13-14]，傳統的紫外方法只以蘆丁為標準進行測定，方法并不能直接體現出活性成分的含量變化，HPLC法可以對黃酮類中的具體物質進行準確地定量測定，因此試驗進一步利用HPLC法確定藥桑中含有綠原酸、蘆丁、槲皮素，并定量得到純化后藥桑提取物中綠原酸、蘆丁、槲皮素的含量分別為1.36、2.54、0.01 μg/mg。方法學驗證證明可以用此方法對黃酮類物質進行質量監控，從而得到純度和含量均較高的黃酮物質。

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