抗農業病害真菌的海洋細菌篩選·發酵及分離初步研究

曲均革 余誠成 陳月新

摘要 [目的]篩選對農業病害真菌有較強拮抗作用的海洋細菌。[方法]以油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）為篩選模型，采用平皿拮抗法篩選抗菌活性，對活性菌株進行發酵工藝優化，并對活性物質提取進行初探。[結果]海洋細菌菌株MB133具有明顯抑菌現象，最優發酵工藝條件為最適培養溫度28 ℃，發酵液中最適葡萄糖濃度2.0%，最適培養時間72 h;熱穩定性試驗表明活性物質對熱不穩定;醇沉法提取有效物質發現抑菌組分在沉淀中。[結論]該研究為農用病害真菌的生物防治擴充了菌種資源。

關鍵詞 海洋細菌;農業病害真菌;發酵工藝優化;分離提取

中圖分類號 S432.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0140-03

Abstract [Objective]To screen the marine bacteria with strong antagonistic effect against agricultural diseases and fungi.[Method]Using Sclerotinia sclerotiorum as the screening model，the antimicrobial activity was screened by plate antagonism method.The optimization of fermentation process and the extraction of active substances from active strains were studied.[Result]The marine bacteria MB133 had obvious bacteriostasis phenomenon.The optimum fermentation conditions were as follows：the optimum culture temperature was 28 ℃，the optimum concentration of glucose in fermentation broth was 2.0%，and the optimum incubation time was 72 hours.Thermal stability test showed that the active substances were unstable to heat.Extraction of effective substances by alcohol precipitation showed that the antimicrobial components were in the precipitation.[Conclusion]This study expanded the strain resources for biological control of agricultural diseases and ?fungi.

Key words Marine bacterium;Agricultural diseases and fungi;Fermentation process optimization;Separation and extraction

近年來化學農藥的過度使用給人類社會帶來了一系列的生態危機和安全隱患[1-3]。相對而言，生物農藥對人畜無毒、環境友好并且不容易產生抗藥性，所以生物農藥是未來農藥發展的希望和方向[4]。 海洋微生物因其具有繁殖迅速、容易大規模培養以及所含次生代謝產物結構新穎、生物活性獨特等特點而備受青睞[5-7]。真菌侵染引起的植物病害位于植物病害起因的首位，它導致農作物大量減產。油菜菌核病是油菜生產中的重要病害之一，發病率高達10%～30%，嚴重的達80%以上，病株一般減產10%～70%，其病原菌屬子囊菌亞門真菌[8-11]。筆者以油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）為篩選模型，開發具有抗農業病害真菌特性的海洋細菌資源，以期為農用病害真菌的生物防治擴充菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海洋細菌菌株。已篩選的海洋細菌菌株MB133為實驗室從寧波象山海域分離純化到的菌種資源[12]。

1.1.2 供試農業病害真菌菌株。油菜菌核病菌（ACCC 37700）來源于中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養基。

1.1.3.1 富集、活化、發酵培養基。采用2216E液體培養基加葡萄糖20 g/L。2216E液體培養基：蛋白胨5.0 g/L、酵母膏1.0 g/L、磷酸高鐵0.01 g/L，人工海水定容至1.0 L，pH 7.6～7.8。

1.1.3.2 農業病害真菌培養基。采用PDA培養基：馬鈴薯提取液1.0 L、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g，自然pH。其中馬鈴薯提取液是取去皮馬鈴薯200.0 g，切成小塊，加水1.0 L，煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 獲得海洋細菌MB133單菌落。在滅菌過的超凈工作臺內，用接種環取一環保藏的海洋細菌菌株MB133，將其在2216E培養基上分區劃線，生化培養箱內28 ℃培養16 h得單菌落。

1.2.2 活化分離得到的海洋細菌。在滅菌過的超凈工作臺上，用接種環取海洋細菌菌株MB133的單菌落，放入1 mL無菌海水內將其打散，倒入含0.5%葡萄糖的2216E液體培養基（30 mL）中，放在25 ℃、170 r/min條件下恒溫搖床培養16 h，為種子液。再將種子液按2%的接種量接入含0.5%葡萄糖的2216E液體培養基中，25 ℃、170 r/min條件下恒溫搖床培養48 h，觀察其活化情況。

1.2.3 發酵條件優化。在250 mL三角瓶中進行液體發酵，將種子液按2%的接種量接入2216E液體培養基中，25 ℃、170 r/min培養48 h。改變某一條件，并保持其他發酵條件不變，通過測量菌株的抑菌圈，研究葡萄糖濃度、發酵溫度及發酵時間對農業病害菌抑菌效果的影響。

1.2.3.1 葡萄糖濃度對抑菌活性的影響。將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于含0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%葡萄糖的2216E液體培養基中（30 mL），pH 7.5～7.8，25 ℃、170 r/min培養48 h，測定葡萄糖濃度對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳發酵糖濃度。

1.2.3.2 發酵溫度對抑菌活性的影響。將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于2216E液體培養基中（30 mL），pH 7.5～7.8，分別在25、28、30、32 ℃，170 r/min培養48 h，測定不同培養溫度對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳發酵溫度。

1.2.3.3 發酵時間對抑菌活性的影響。將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于2216E液體培養基中（30 mL），pH 7.5～7.8，放入25 ℃培養箱，170 r/min分別培養24、48、72 h，測定發酵時間對油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳發酵時間。

1.2.4 離心發酵液。取活化后的MB133菌液2 mL于離心管中，于4 ℃、13 000 r/min條件下冷凍離心10 min，取其上清液。

1.2.5 抑菌活性測量。用接種鏟將固體培養基上生長的油菜菌核病菌接種至PDA平板正中間（菌落直徑為7～8 mm），在每塊平板下方用記號筆劃出6個相等的區域，每個區域做好標記。用鑷子夾取牛津杯放在每個標記區域的正中間，用移液槍向牛津杯中加入200 μL發酵上清液，每個處理3個重復，25 ℃生化培養箱中培養6 d，測量抑菌圈直徑。

1.2.6 抑菌物質的熱穩定性研究。將提取得到的發酵上清液平均分為6份，分別置于40、60、80、100和120 ℃高溫高壓下水浴1 h，并用平皿拮抗法測量是否有抑菌現象，對照為不做處理的發酵上清液。

1.2.7 醇沉法提取活性物質。將發酵液于4 ℃下13 000 r/min離心，上清液和無水乙醇按1∶3混合，再離心，將上清液旋轉蒸發除去乙醇，然后將其與用無菌水溶解后的沉淀用平皿拮抗法測量是否有抑菌現象，對照為不做處理的發酵上清液。

2 結果與分析

2.1 發酵條件優化

2.1.1 葡萄糖濃度對抑菌活性的影響。由圖1可知，25 ℃培養48 h后，2.0%葡萄糖濃度的發酵液抑菌活性最強，抑菌圈直徑12 mm，所以最佳葡萄糖濃度為2.0%。

2.1.2 發酵溫度對抑菌活性的影響。培養48 h后，離心取上清，采用平皿拮抗法對油菜菌核病菌進行抑菌活性比較。由圖2可知，當溫度為28 ℃時，抑菌圈直徑最大，可以達13.8 mm，故最佳發酵溫度為28 ℃。

2.1.3 發酵時間對抑菌活性的影響。由圖 3可知 ，MB133菌株產生抑菌活性物質隨時間的延長而增加，24 h抑菌圈直徑為0，48 h抑菌圈直徑為8.50 mm，72 h抑菌圈直徑達12.15 mm，菌株產生的抑菌物質最多，因此確定72 h為最佳發酵時間。

2.2 有效抑菌物質的熱穩定性 由圖4可知，當溫度超過40 ℃后就沒有抑菌圈出現，所以有效抑菌物質對熱不穩定。

2.3 用醇沉法提取有效物質 發酵液上清經無水乙醇提取，對提取液上清及沉淀分別進行抑菌活性檢測，如圖5所示，只有沉淀和對照出現了抑菌圈，即沉淀對油菜菌核病菌具有抑制作用，所以有效抑菌物質在沉淀中。

3 結論

該研究所用菌株MB133是從寧波象山海域分離純化到的海洋細菌，經平皿拮抗法篩選后發現其對農業病害真菌具有較明顯的抑菌作用。經發酵條件優化發現最適培養溫度為28 ℃，最適葡萄糖濃度為2.0%，最適發酵時間為72 h;熱穩定性試驗表明活性物質具有熱不穩定性;醇沉法提取有效物質發現抑菌組分在沉淀中。下一步將深入開展抑菌組分的分離提取研究，以期為農用抗生素的推廣和應用奠定基礎。

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