原花青素對HL-60細胞分化及凋亡的影響

謝朝陽 吳斌華 陳小芳 陳秋生 祝 娟 祝其鋒

(廣東醫學院檢驗醫學研究所，廣東 湛江 524023)

原花青素(PAC) 以其高效、低毒、高生物利用度而被不斷研究開發，研究表明PAC有抗動脈粥樣硬化、抗氧化損傷等作用。本課題組前期研究結果提示PAC可劑量依賴性對抗Aβ25～35對PC12細胞的毒性作用，其保護神經元受損機制可能與逆轉紊亂的細胞周期有關〔1〕。近來研究結果表明，PAC可抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡〔2〕，阻滯細胞周期〔3〕等，起到抗腫瘤的作用。但國內外關于PAC對白血病細胞的作用研究極少，本文以人急性髓細胞白血病細胞株HL-60為模型，探討PAC對HL-60細胞增殖、分化及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、試劑、儀器 HL-60 細胞購于中科院上海細胞庫。胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品；RPMI1640購自GIBCO公司；CD14、CD11b 為BD Pharmingen產品；CCK-8試劑盒購于碧云天；各種規格培養皿均為美國Corning Costar公司產品；其余試劑為國產分析純。EPICS XL流式細胞儀為美國COULTER公司；OLYMPUS BX41光學顯微鏡為日本OLYMPUS，SSC-DC83P攝像頭為日本SONY公司。M450型ELISA Reader 酶標儀為美國Bio-Rad公司。

1.2實驗藥物 PAC購于南京清澤醫藥公司，為葡萄籽提取物，質量分數大于95%，用DMSO溶解配成貯存液，DMSO終濃度<0.1%(V/V)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 細胞培養在含12% 胎牛血清的RPMI1640培養液中(內含0.1% 青霉素)，置于37℃、5%CO2孵育箱內備用。

1.3.2CCK-8法檢測 HL-60細胞增殖抑制 用WST-8(CCK-8)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測。取對數生長期細胞，調節細胞數為1×105cells/ml，于96孔培養板中每孔加100 μl，細胞濃度為1×104cells/ml，加入不同終濃度的PAC，對照組除未加PAC外其余條件完全一致，置37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養24 h、48 h和72 h。培養至實驗時間結束前3 h，各孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續孵育3 h，測定450 nm處的OD值，重復三次，以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制增殖抑制曲線。

1.3.3細胞形態學觀察 調整HL-60細胞數為2×105/ml，每孔2 ml種入6孔板中，加終濃度分別為20 mg/L、40 mg/L的PAC誘導24 h、48 h，離心收集細胞，用PBS洗2次，去上清，制細胞涂片，用Wright染色，光鏡觀察形態變化。

1.3.4流式細胞檢測細胞周期變化 取對數生長期的HL-60細胞以3×108個/L接種于6孔板，每孔加2 ml，加入終濃度為20 mg/L、40 mg/L的PAC，培養24 h。收集細胞至1.5 ml EP管中，PBS洗2次，800 r/min 離心10 min，70% 乙醇-20℃固定過夜，用PBS洗1次，1 200 r/min離心10 min，每管加PI至終濃度為50 mg/L，37℃避光孵育30 min，過濾后上機檢測。每個樣品計數10 000個細胞，每組重復3次取平均值。

1.3.5細胞表面分化檢測 調整HL-60細胞數為2×105/ml，每孔2 ml種入6孔板中，加終濃度分別為20 mg/L的PAC誘導24、48 h，采用FCM檢測髓系主要分化抗原CD14 、CD11b表達變化。離心收集細胞，分別加入鼠抗人FITC-CD14單抗和PE-CD11b單抗5 μl，加PBS至100 μl ，4℃孵育30 min，PBS洗，1次，重懸于PBS，經400目尼龍網過濾，用流式細胞儀檢測CD14和CD11b抗原表達。

2 結 果

2.1PAC對HL-60細胞生長增殖的影響 不同濃度PAC處理HL-60細胞24、48 h，用CCK-8法檢測細胞存活率，結果顯示作用24 h，隨PAC濃度從5～40 mg/L逐漸增高，細胞存活率逐漸降低(P<0.05)，表明PAC對細胞的抑制作用隨濃度的增大而增強(圖1)。當PAC濃度為20 mg/L時，HL-60細胞的增殖抑制率為(72.3±1.8)%，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。不同濃度PAC作用HL-60細胞48 h，增殖抑制率比24 h的稍高，但差異無統計學意義，且50 mg/L PAC作用HL-60細胞48 h，細胞出現死亡現象。

圖1 PAC對HL-60細胞生長增殖的影響

2.2細胞形態學觀察 細胞涂片經Wright染色，油鏡下可見，未經藥物作用的HL-60細胞胞體大、核大、多為圓形、核仁清晰、胞質深染、核質比例大。經20 mg/L PAC作用24 h，少數細胞出現核凹陷變形；作用48 h部分細胞體積變小，核形變得不規則，呈現腎形、分葉狀等，核仁不清或消失，胞質變多，部分可見染粉紅色，提示部分細胞分化為較成熟階段細胞。而40 mg/L的PAC作用HL-60細胞48 h，細胞則出現凋亡改變，細胞核固縮、碎裂(箭頭所示)，見圖2。

圖2 HL-60細胞形態觀察

2.3PAC對HL-60細胞細胞周期分布的影響 流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，經PAC(5～20 mg/L) 處理24 h后，G0/G1期細胞呈劑量依賴性的上升，當PAC濃度為20 mg/L時，細胞周期G0/G1期百分比與對照組(46.3%)比較明顯增高(77.5%)(P<0.05)；S期細胞數明顯減少(18.3%，對照組為45.5%)。而當PAC濃度為30 mg/L后，G0/G1期細胞百分率開始降低(50.2%)，S期逐漸升高(35.1%)。而40 mg/L的PAC作用HL-60細胞24 h，G2/M期細胞百分比明顯增高(22.4%)，并出現凋亡峰。

2.4PAC影響HL-60細胞表面分化抗原的表達 20 mg/L的PAC誘導HL-60細胞24 h，流式細胞術檢測髓系較成熟階段細胞分化抗原CD14表達(15.78%)與對照組(0.33%)比較明顯增高(0.89% vs 0.31%)，CD11b表達稍增高，提示HL-60細胞向成熟階段細胞分化。

3 討 論

PAC是一類由葡萄、山楂、松樹皮、銀杏等植物中提取的多酚類聚合物。研究表明PAC能夠減輕腦出血大鼠的細胞凋亡，其機制可能與PAC提高機體的抗氧化能力，同時增強抗凋亡基因bcl-2的表達，降低促凋亡基因bax 的表達有關〔4〕。PAC 可通過減輕腦水腫、改善腦組織的代謝障礙而對腦缺血發揮保護作用〔5〕。研究還表明PAC可以抑制消化道腫瘤、前列腺癌等多種腫瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡〔6，7〕，提示PAC有可能成為極有希望的低毒、高效的抗腫瘤藥物。但國內外關于PAC對白血病細胞作用的研究報道極少。Hu等〔8〕研究表明低劑量GSPE(葡萄籽原花青素)可誘導人急性髓細胞白血病14.3D10細胞凋亡，但對人正常外周血細胞無影響，提示PAC在治療白血病方面具有一定的應用前景。本研究結果表明PAC可劑量依賴性抑制細胞的增殖，隨著作用時間的延長，抑制率呈增高趨勢，但差異不明顯。提示PAC對HL-60細胞的生長增殖有抑制作用。Feng等〔9〕以花青素誘導氧化應激殺傷白血病細胞實驗中，細胞雙染色檢測凋亡發現，當花青素濃度為50 μg/ml，培養18 h后，HL-60細胞發生凋亡。本文PAC致HL-60細胞凋亡濃度與其比較偏低，但誘導時間延長，推測為實驗室間培養或細胞株來源差異所致。陳夏靜等〔10〕用復方維甲酸注射液在誘導K562細胞分化成熟過程中CD14表達增高。許培權等〔11〕用全反式維甲酸對HL-60細胞誘導分化中CD11b表達增高。本實驗CD11b表達稍增高。國內在利用誘導劑誘導白血病細胞分化研究多有CD11b表達增高，而Park等〔12〕則認為CD11b是細胞黏附分子整合素家族成員之一，參與細胞的黏附與遷移，最早檢測到CD11b 是造血細胞發育過程中髓系祖細胞和原單核細胞階段，隨著進一步分化，其表達逐漸減低。提示CD11b在白血病細胞中的表達尚不明確。

本實驗結果提示PAC能抑制HL-60細胞增殖，低濃度PAC能誘導其分化為較成熟階段細胞，隨濃度的增加分化效應反而降低，高濃度PAC則可能誘導HL-60細胞發生凋亡。表明PAC對急性髓系HL-60細胞株具有雙效作用，其機制可能與細胞周期變化有關。

4 參考文獻

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11許培權，龔建平.全反式維甲酸對HL-60細胞分化和凋亡的影響〔J〕.癌癥，2004；23(2)：118-23.

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