UPLC-MS/MS 法測定凡納濱對蝦中呋喃西林新型生物標志物

胡夢玲，張小軍，嚴忠雍，梅光明，方雙琪,，張 帥,

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316022)

硝基呋喃類抗生素是一系列廣譜抗菌藥物的總稱，常用的主要有以下4 種：呋喃唑酮(Forazolidone,FZD)、呋喃它酮(Furaltadone,FTD)、呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ)和呋喃妥因(Nitrofurantoin,NFT)[1-2]，以呋喃西林為例，原藥及其代謝產物氨基脲的2-硝基苯甲醛(NP)衍生物結構式如圖1 所示。

圖1 原藥呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)及其衍生物(NP-SEM，DNPH-NF)的結構圖Fig.1 Structure diagram of parent NFZ and derivatives

硝基呋喃類藥物是人工合成的一類廣譜抗菌藥物[2-4]，此類抗生素以其良好的抗菌作用、藥物代謝較快的特性和價格低等特點[5-6]，最早被用于家禽、家畜、水產養殖動物細菌性疾病的防治[3]。常因用于預防和治療魚類及畜禽類因感染沙門氏菌和大腸埃希菌而產生的疾病在畜牧業及水產養殖中曾被廣泛使用[2-3]。

硝基呋喃類藥物在生物體內代謝速率非常快[7-8]，消除半衰期從幾小時到十幾小時不等，因此，從飼料或給藥動物體內檢測硝基呋喃原形藥是比較困難且不準確的，原藥的殘留量不足以反映真實的用藥情況。然而，硝基呋喃的代謝產物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(semicarbazide，SEM)、1-氨基-2-內酰脲(AHD)、3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)能與組織蛋白結合而長期存在[8-12]。硝基呋喃類藥物有一定的毒性，尤其代謝物被證實長期服用具有潛在的“三致”作用(致癌、致畸和致突變)[13-17]。因此包括中國在內的大多數國家已禁止在動物源性食品中使用[18-19]。目前針對呋喃西林違禁用藥的檢測方法主要有酶聯免疫法(ELISA)[5,12]、原子吸收法[14]高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[5,8,16]、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[18-19]、免疫膠體金法[9]和分光光度法等。基于SEM 為生物標志物的檢測方法無法分辨“陽性”的SEM 究竟來自于呋喃西林還是自然產生，這使得沿用至今的SEM 是否能夠繼續作為呋喃西林檢測的標志物在業內引起了巨大爭議[15,17]。近年來，研究人員開發了新的檢測方法以及探索新型的呋喃西林生物標志物以解決SEM 檢測“假陽性”問題。WANG Yuesong，et al[20]對呋喃西林在鯰魚體內的代謝途徑進行了研究，提出了一種全新的氰基代謝物，并認為可替代SEM 作為呋喃西林檢測的確證標志物。對于這種全新的標示物，相關文獻僅用同位素質譜法進行了分析推斷，如果能夠分離出純物質，采用核磁等方法對氰基代謝物結構加以確證，則會更加有說服力。

判定硝基呋喃類抗生素是否用藥的傳統檢測方法是通過測定其生物標志殘留物來實現的，以檢測呋喃西林代謝物氨基脲(SEM)為例，在適當的酸性水解氛圍下，與組織蛋白結合的SEM 會重新游離出來。從檢測的角度出發，SEM 是一類小分子量化合物，對液相色譜常用的紫外和熒光檢測器響應均不理想，因而加入2-硝基苯甲醛(NP)作為衍生化試劑，衍生產物NP-SEM 如圖1 所示，經過分離純化后，用UPLC/MS/MS 分析，檢測限可達歐盟法規要求的1 μg·kg-1[21]。

本研究以5-硝基-2-糠醛(NF)為新型生物標志物，經2,4-二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生后，將NF 轉化成穩定的腙類化合物，再進行分離提取并檢測，用于識別和確證因呋喃西林用藥殘留問題，傳統SEM 與新型NF 標志物衍生途徑分別如圖1 所示。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5-硝基-2-糠醛標準品(CAS：698-63-5，純度>97%)，日本東京化工集團；呋喃西林、氨基脲鹽酸鹽、13C15N2氨基脲鹽酸鹽同位素標準品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；呋喃西林藥粉，商丘市亮峰衛生用品有限公司；DNPH-NF 衍生物標準品，浙江省海洋水產研究所實驗室自制；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、(均為色譜純)，德國Merck 公司；甲酸、乙酸銨(均為色譜純)，美國Sigma 公司；2,4-二硝基苯肼、硫酸、鹽酸、無水磷酸氫二鉀(均為AR)，上海國藥集團有限公司；實驗用水均為Millipore-Q 系統制備的超純水。

1.2 儀器與設備

ACQUITYTM UPLC I-Class/Xevo TQ-S 液相色譜-串聯質譜儀(配有電噴霧離子源) 美國Waters 公司；SPE-24 固相萃取裝置 美國supelco 公司；N-EVAP-11634 氮氣吹干儀 美國Organomation 公司；LPD2500多管漩渦混合儀萊普特科學儀器(北京) 有限公司；超聲波清洗器上海科導超聲儀器有限公司；Centrifuge 5810 高速離心機 德國Eppendorf 公司；Oasis PRiME HLB 凈化柱(柱容量3 mL)美國Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1)：分別稱取二水合磷酸二氫鈉2.18 g，十二水合磷酸氫二鈉12.90 g，氯化鈉8.50 g，用水溶解并定容至1 000 mL。

鹽酸溶液(0.2 mol·L-1)：量取濃鹽酸6 mL，用水溶解并定容至1 000 mL。

2,4-二硝基苯肼衍生化試劑：精確稱取藥品250 mg 于250 mL 棕色容量瓶中，先用5 mL 乙醇溶解，再加入2.5 mL 鹽酸，后用乙醇定容至250 mL，配制成濃度為1 mg·mL-1的使用液，在4 ℃下避光保存。

NF-DNPH 標準溶液：精確稱取適量的NF-DNPH 標準品粉末，用乙腈稀釋定容至50 mL 容量瓶，4 ℃避光保存，保存時間為6 個月；使用時用乙腈逐級稀釋至100 μg·L-1備用。

1.3.2 呋喃西林暴露實驗

實驗所用凡納濱對蝦購于浙江省舟山市臨城華潤萬家超市，運送至實驗室后，立即暫養于配有增氧泵的水槽中，24 h 后檢查并剔除死亡的對蝦，隨后選取個頭較小的對蝦制樣，檢測硝基呋喃殘留。判定空白無殘留后，挑選個體長度、鮮活程度均等的對蝦進行藥物暴露實驗。

因甲殼類動物的特殊性，通過口服、注射等方式難以達到預期的給藥效果，結合水產用藥的實際情況，本文擬采用藥浴的方式給藥。稱取5、50、500 mg 的呋喃西林藥粉，溶解于5 L 水中，分別制成濃度為1、10、100 mg·L-1呋喃西林藥浴，如圖2 所示，將檢測為空白的對蝦(每只約15 g)放入藥浴中浸泡24 h 后，按標準規范要求去殼后混合制樣檢測。

1.3.3 樣品前處理

稱取1.00 g(準確到0.01 g)待測樣品，置于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 稀鹽酸(0.2 mol·L-1)，100 μL 2,4-二硝基苯肼(衍生試劑DNPH，1 mg·L-1)，渦旋振蕩1 min，超聲振蕩30 min 后，用磷酸氫二鉀(0.1 mol·L-1)調pH 至7.5 后，將8 mL 乙酸乙酯分2 次加入，7 000 r·min-1離心5 min，合并上清液至15 mL 離心管，在40 ℃水浴條件下氮吹濃縮至干，加入1 mL 流動相乙腈/水(7：3，V/V)溶解，旋渦振蕩1 min，經Oasis PRiME HLB 凈化柱除雜，過0.22 μm 有機微孔濾膜后，液相色譜-質譜分析。

SEM 檢測方法參照《農業部783 號公告-1-2006 水產品中硝基呋喃代謝物殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》[22]。

圖2 凡納濱對蝦的呋喃西林藥物暴露實驗Fig.2 L.vannamei exposure to nitrofurazone

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYTM UPLC BEH C18 柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；進樣量10 μL；樣品室溫度4 ℃；流動相A 為純水(2 mol·L-1乙酸銨)，B 為乙腈，柱溫40 ℃；流速0.2 mL·min-1；梯度洗脫：0～4.0 min，70%～30%A；4.0～6.0 min，30%A。

1.3.5 質譜條件

電噴霧離子源，DNPH-NF 檢測為負離子掃描(Electrospray ionization，ESI-)模式；NP-SEM 檢測為正離子掃描方式：多反應監測模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：380℃；毛細管電壓：2.5 kV；錐孔氣流量：60 L·h-1；脫溶劑氣流量：600 L·h-1；錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質譜多反應監測實驗條件如表1。

表1 分析物的質譜多反應監測實驗條件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring for analyte

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

由于沒有商品化的5-硝基-2-糠醛衍生物標準品可購買，因此本實驗組合成并提純了NF-DNPH，該衍生物的質譜分析條件也無相關文獻可供借鑒，分別在電噴霧正、負離子掃描模式下以10 μL·min-1流動注射NF-DNPH 標準溶液，發現該化合物在負離子模式下的響應靈敏，質譜信號強。因此選擇電噴霧負離子模式對分析物的質譜參數進行優化。經過一級質譜掃描分析確定NF-DNPH 的母離子峰[M-H]-為m/z 320.07。通過二級碰撞誘導分析收集分析物子離子信息，選取m/z 320.07>273.08 和m/z 320.07>179.07 豐度最強的兩個離子碎片峰作為分析物的子離子，并對錐孔電壓，碰撞能量等參數進一步優化，如圖3 所示，得出最佳的質譜多反應監測條件列于表1。

圖3 優化的錐孔電壓、碰撞能和子離子質譜碎裂圖Fig.3 Optimization of cone volatage collision energy and daughter spectrum

2.2 衍生化條件的優化

柱前衍生反應通常受溫度、衍生時間、酸濃度、衍生試劑用量等條件的影響，衍生化條件對衍生效率的影響至關重要并最終影響定量檢測的精確性，為提高前處理的高效性，需對柱前衍生反應進行優化。由于5-硝基-2-糠醛本身的熱不穩定性，溫度過高容易造成分解，衍生效率低，定量不準確；而衍生化溫度過低，導致衍生過慢而反應不完全，綜合考慮本文采用室溫，25 ℃，作為衍生反應溫度。

2.2.1 鹽酸用量

5-硝基-2-糠醛與2,4-二硝基苯肼的衍生化反應過程，屬于羰基的親核加成反應，反應過程中溶液的酸性氛圍可以加強羰基碳的正極性，有利于促進親核加成反應的進行。因而合適的酸性條件下有利于衍生化反應的順利完成。實驗選取5～30 mL 鹽酸(0.2 mol·L-1)進行實驗，以鹽酸體積與與衍生物峰面積作關系曲線，從圖4 可以看出，當加入的鹽酸體積超過10 mL 后，衍生物峰面積基本無變化，考慮到磷酸氫二鉀中和后的體積，本文選取10 mL 作為鹽酸用量。

2.2.2 衍生時間

選取10～60 min 進行實驗，以為衍生時間和衍生物峰面積作關系曲線，從圖5 可以看出，衍生物峰面積隨著衍生時間增加而逐漸提高，10～30 min 時間段提高較為顯著，30 min 達到峰值并趨于穩定，可以視為衍生反應基本完全，因此本文選取30 min 作為最佳衍生化時間。

2.2.3 衍生試劑用量

2,4-二硝基苯肼在反應里將較不穩定的5-硝基-2-糠醛轉化為腙類，以便衍生物在后續的樣品前處理過程中能夠穩定存在，因此衍生化試劑的用量對目標化合物的回收率有重要作用。實驗對2,4-二硝基苯肼(1 mg·L-1)的用量從50～300 μL。以衍生化試劑的用量和衍生物峰面積作關系曲線，從圖6 可以看出，衍生物峰面積隨著衍生化試劑的增加而逐漸提高，當用量為100 μL 時候，峰面積達到最高；用量超過100 μL 以后，反而使得峰面積逐漸下降，這可能是由于過量的衍生化試劑使得基質效應增強而干擾了質譜檢測，因此要嚴格控制2,4-二硝基苯肼的用量，本文選取100 μL 作為2,4-二硝基苯肼的最佳用量

圖4 鹽酸用量對分析物的影響Fig.4 The amount of hydrochloric acid on the impact of the analyte

圖5 衍生時間對分析物的影響Fig.5 Derivation of the impact of the analyte

圖6 衍生試劑用量對分析物的影響Fig.6 Influence of derivative reagent on analyte

2.3 方法驗證

為了測試衍生物的穩定性和特異性，在2 個月的周期內，將DNPH-NF 的標準溶液每隔2 周分析1 次，色譜峰面積的相對標準偏差小于5%，這表明DNPH-NF衍生物具備足夠的穩定性，可以存放數月。用分析不同種類空白樣品(魚，蟹和蝦)的方式考察衍生物的特異性。樣品的質譜離子流圖顯示，檢測目標物峰形對稱且附近沒有基質效應的干擾作用。

將6 種不同濃度的標準溶液各分析3 次，用于建立標準曲線。在上述優化的柱前衍生、色譜-質譜條件下，DNPH-NF 在0.4～20 μg·kg-1的濃度范圍內，NP-SEM 在0.5～20 μg·kg-1的濃度范圍內線性良好。線性方程相關系數分別為：r2=0.993，r2=0.995。DNPH-NF 用外標法定量，而NP-SEM 采用13C15N-SEM 內標法定量。實際樣品的DNPH-N 與NP-SEM 加標回收率范圍分別為83.4%～90.3%、85.3%～93.1%，相對標準偏差<10%。方法的理論檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算，最終確定新型生物標志物檢出限和定量限分別為0.3 μg·kg-1和1.0 μg·kg-1。

2.4 實際樣品的分析

為考察方法的適用性和實用性，采用本方法對空白及不同濃度呋喃西林浸泡后的凡納濱對蝦樣品進行分析檢測。

如圖7 所示，空白組結果有1～5 μg·kg-1的SEM 檢出，說明SEM 內源性問題是存在的；而5-硝基-2-糠醛檢出量低于檢測限，表明對蝦中NF 無內源性產生。

圖7 空白對蝦樣品的MRM 圖譜Fig.7 MRM chromatograms of blank L.vannamei

如圖8 所示，檢測結果表明，在1、10 和100 mg·L-1的呋喃西林浸泡條件下，24 h 后取樣分析，SEM 在蝦肉中殘留分別為55，325 和2 187 μg·kg-1。

圖8 凡納濱對蝦中NP-SEM 質譜圖，正離子模式Fig.8 MRM chromatograms of NP-SEM in L.vannamei after the administration of NFZ,positive electrospray ionization

如圖9 所示，檢測結果表明，在1、10 和100 mg·L-1的呋喃西林浸泡條件下，24 h 后取樣分析，NF 在蝦肉中殘留分別為2.7、19 和173 μg·kg-1。

圖9 凡納濱對蝦中DNPH-NF 質譜圖，負離子模式Fig.9 MRM chromatograms of DNPH-NF in L.vannamei after the administration of NFZ,negative electrospray ionization

與NP-SEM 檢測相比，DNPH-NF 檢測結果偏低[10]幾十倍，除了代謝殘留量較低的原因，還有一個因素則是SEM 的檢測為內標法定量，13C15N-SEM 同位素內標物可以補償樣品前處理帶來的損失，由于5-硝基-2-糠醛的同位素內標物沒有出售，因而本文采用了外標法定量[12]，也會導致測定結果比真實值偏低。

3 結論

本研究利用5-硝基-2-糠醛為生物標志物檢測呋喃西林殘留，方法特異性好，無內源性問題[14]，衍生化時間短，大大節省了樣品前處理的時間，且衍生物性質穩定、質譜響應好，檢測靈敏度低至0.3 μg·kg-1。鑒于5-硝基-2-糠醛的化學特性及其在凡納濱對蝦中的實際代謝殘留量，本方法可以與傳統的氨基脲檢測方法配合使用，適用于對蝦等氨基脲內源性問題樣品的呋喃西林初期用藥情況的判定。