過量表達鹽芥TsIPK2基因增強轉基因水稻耐鹽性

潘曉雪，胡明瑜，蔣曉英，白文欽，官 玲，吳 紅，雷開榮

（重慶市農業科學院生物技術研究中心/逆境農業研究重慶市重點實驗室，重慶 401329）

磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)信號通路是植物細胞信號轉導中的一種重要的胞內信使系統，在植物生長發育和對環境因子的響應中發揮著重要作用[1]。磷脂酰肌醇信號調控是通過一系列肌醇激酶和肌醇磷酸酶來實現的，其中多磷酸激酶是磷脂酰肌醇信號通路中的一個關鍵酶。多磷酸激酶是一類磷酸肌醇6-/3-雙激酶，它能夠在6位和3位磷酸化Ins (1,4, 5) P3生成Ins (1, 4, 5) P4并進一步生成Ins (1, 4, 5)P5。多磷酸激酶最早在酵母中被發現并稱為IPK2(inositol polyphosphate kinase)，但其在哺乳動物中通常又叫做IPMK (inositol polyphosphate multkinase)[2-4]。最早通過同源性比對從擬南芥中鑒定出來兩個多磷酸肌醇激酶，分別命名為AtIPK2α和AtIPK2β，生化分析實驗證明AtIPK2α和AtIPK2β都具有多磷酸肌醇激酶家族代表性的6-/3-雙激酶催化活性，同時還發現AtIPK2β很可能也參與植物轉錄調控[5-6]，此后多磷酸肌醇激酶基因陸續從水稻、馬鈴薯和鹽芥中克隆出來[7-9]。AtIPK2β不僅可以互補酵母scipk2突變體在正常條件下生長緩慢的缺陷，而且還能提高其在鹽、滲透以及高溫條件下的生長耐受力，暗示AtIPK2β很可能還參與逆境應答過程[6,10]。與野生型相比，異源表達AtIPK2β的轉基因煙草對鹽、干旱以及氧化脅迫表現出明顯的耐受性，轉AtIPK2β基因煙草能夠通過減少鈉離子積累，增加脯氨酸含量和過氧化氫酶活性，并表達應激相關基因以提高煙草的耐脅迫能力[10]。OsIPK2在水稻多種組織中都有表達，而且同樣能夠互補酵母scipk2突變體的生長缺陷[7]。鹽芥是一種新型耐鹽模式植物, 序列比對發現鹽芥TsIPK2與AtIPK2β具有較高的同源性，也能夠互補脅迫處理下酵母scipk2突變體的生長缺陷表型。過量表達TsIPK2可以增加轉基因油菜對鹽、干旱和氧化脅迫的耐受性[9]。過量表達鹽芥TsIPK2的大豆株系比受體品種具有更高的耐鹽脅迫能力[11]。以上這些研究表明參與逆境應答很可能是植物IPK2基因一個較為普遍的功能。

水稻是我國主要的糧食作物，隨著人口增加和鹽漬化土地面積的不斷擴大，培育耐逆水稻品種已成為當務之急，在此基礎上，本研究將鹽芥TsIPK2基因通過農桿菌浸染愈傷法在水稻中進行過量表達，利用NaCl模擬鹽脅迫環境，研究TsIPK2基因在植物耐鹽脅迫中的作用，以期揭示TsIPK2基因的耐逆機制，豐富TsIPK2基因的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料粳稻‘秀水03’ (WT)由本中心保存；上海植生所張洪霞研究員提供過量表達TsIPK2(Gen-Bank登錄號為EF110977)基因載體(pCAMBIA1301-TsIPK2)[9]。

1.2 方法

1.2.1 轉TsIPK2基因水稻株系的獲得及分子檢測

采用農桿菌介導愈傷轉化法獲得轉基因水稻植株，幼苗生長旺盛后，取葉片提取基因組DNA，并使用TsIPK2基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)的特異性引物(正向引物: 5′- ATGCTCAAG GTCCCTGAACAC-3′； 反向引物: 5′-CTAGTGCC CGTTTTCAAGCTG-3′)進行PCR擴增，1%瓊脂糖電泳檢測目的條帶, 篩選出基因組中有TsIPK2基因整合的水稻植株，獲得T1代種子。利用Trizol試劑(Invitrogen)參照說明書提取T1代轉基因幼苗RNA，按照說明書取2～3 μg RNA用M-MLV逆轉錄酶(Promega)進行cDNA的第一鏈合成, 反轉錄后用TsIPK2基因ORF區特異性引物(正向引物: 5′-CGGATGTGTCGGAAGAATACT-3′，反向引物: 5′-GCGAAATCCACCAGCTTTAC-3′)進行 RT-PCR 擴增, 選用水稻ubiquitin 1(OsRub1)基因(正向引物: 5′-GACAATGTGAAAGCCAAGATC-3′，反向引物: 5′-GACTCAACCTCAAGGGTAATG-3′)作為內參基因，1%瓊脂糖電泳檢測結果，驗證TsIPK2基因是否能在水稻中正常表達。鑒定的陽性植株幼苗移栽到試驗田中繼續生長以收獲T2代種子，自交純化后得到T3代植株用于后續試驗。

1.2.2 水稻種子萌發的測定 挑選T3代籽粒飽滿、大小一致的轉基因株系(Line 2和Line 3)和秀水03 (WT)種子，種子在50℃烘箱中干燥2天，打破休眠。然后將種子用0.1%(w/v)的HgCl消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗干凈。將種子放入培養皿(皿底墊兩層濾紙) 中，每個培養皿中放50粒種子，采用NaCl單鹽溶液進行處理，設置0、50、100、150、200 mmol/L 5個體積濃度梯度，處理組分別加入10 mL NaCl水溶液，對照組加入等量的蒸餾水，將培養皿放置在30℃的黑暗條件下萌發，至第10天記錄種子發芽率(以芽長達到種子長度一半，根長達到種子長度作為種子發芽的標準)，三次重復，每一重復隨機取30粒測量芽長、主根長，計算平均值。

1.2.3 轉基因水稻植株的耐鹽性分析 將種子按上述方法進行消毒并用蒸餾水沖洗干凈，然后在37℃培養箱中浸種催芽2天，將露白種子直接播于96孔PCR板上，將PCR板置于塑料盒中，在26℃光照培養箱內生長，光照強度2500 lx、光照14 h。待苗長至3葉期時剔除弱苗，選取均勻一致的幼苗用0、50、100、150、200 mmol/L的NaCl處理，每3天換1次營養液，處理2周后選取葉片測定各項生理生化指標，每個處理重復3次。在南京建成生物工程公司購買脯氨酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒，各生理指標的測定均設置3次重復。

1.2.4 脅迫處理下TsIPK2基因的表達分析 取脅迫處理前后的樣品，方法同上。基因特異性引物(表1)設計由Primer 5.0完成，PCR在定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，Foster City，USA)上進行，用 SYBR Green I dye (Takara Bio Inc.，Otsu，Japan)進行分析。qRT-PCR反應條件為：初始變形95℃，30 min；然后95℃，5 min，58℃，34 min，重復上述兩步40次；融解階段為95℃，15 min，60℃，60 min，95℃，15 min。水稻ubiquitin 1(OsRub1)(GenBank登錄號：AF184729)基因作為內參。qRTPCR的樣品包括3次生物重復和3次技術重復。

1.2.5 數據分析 數據、表及文字處理采用Office 2007軟件，其中部分數據用SPSS20.0進行統計分析，用OriginPro8繪圖。

2 結果與分析

2.1 轉基因植株的分子檢測

在本研究中，再生植株DNA使用TsIPK2基因的特異性引物擴增。轉TsIPK2基因水稻的3個株系中均擴增出一條約882 bp的特異性帶，在野生型植株中未檢測到相同的條帶(圖1A)，表明TsIPK2基因已成功整合到水稻基因組中。然后提取植株RNA，進行RT-PCR檢測(圖1B)，結果顯示TsIPK2基因能夠在水稻中正常表達。

2.2 TsIPK2在鹽脅迫下的表達分析

分別提取水稻三葉期幼苗在200 mmol/L的NaCl處理0、1、3、6、12和24 h的葉片總RNA，以水稻ubiquitin 1(OsRub1)基因作為內參，分析在鹽脅迫下TsIPK2的表達特征。在200 mmol/L的NaCl處理下，TsIPK2的轉錄水平在處理1 h后增加，3 h后達到峰值，6 h后下降，隨著處理時間的延長，依然高于未處理時的表達水平(圖2)。這表明在鹽脅迫下TsIPK2基因在脅迫下能迅速響應。

2.3 鹽脅迫對水稻種子發芽率的影響

隨著NaCl濃度的增加，轉基因株系和野生型發芽率都受到抑制，但野生型發芽率顯著低于轉基因株系(圖3)。在150 mmol/L NaCl的處理下，轉基因株系的發芽率均在60%以上，而野生型的發芽率在30%左右。這表明野生型水稻種子的發芽率在高濃度NaCl處理下受到更顯著的抑制(圖3)。

表 1 用于實時定量PCR分析的引物信息Table 1 Genes specific primers used for quantitative RT-PCR analysis

圖 1 轉基因水稻的PCR和RT-PCR檢測Fig. 1 PCR and RT-PCR detection in different transgenic rice lines

圖 2 TsIPK2在高鹽脅迫下的表達特征Fig. 2 Expression of TsIPK2 under salt stress

2.4 鹽脅迫對水稻種子幼根及芽生長的影響

與野生型相比，不同濃度鹽脅迫下轉基因水稻的根長和芽長均高于對照，在200 mmol/L NaCl處理下，轉基因水稻L2和L3株系的平均芽長比野生型分別高出8.2%和11.6%，平均根長比野生型分別高出17.1%和19.1%，說明轉基因水稻具有較好的生長優勢 (圖 4)。

圖 3 鹽脅迫下轉基因水稻幼苗的發芽率Fig. 3 Germination rate of two transgenic rice lines under salt stress

2.5 鹽脅迫對水稻生理指標的影響

圖 4 不同鹽濃度脅迫下轉基因水稻的根長和芽長Fig. 4 Root and shoot length of transgenic rice under different salt stress concentrations

2.5.1 鹽脅迫下水稻的脯氨酸和丙二醛(MDA)含量正常生長條件下，轉基因水稻葉片的脯氨酸含量略高于野生型。鹽脅迫處理14 d后，野生型和轉基因水稻葉片中的脯氨酸含量都急劇增加，但轉基因水稻積累更多游離脯氨酸。在150 mmol/L NaCl濃度下，轉基因株系L2和L3的脯氨酸含量的增幅分別是野生型的1.29倍和1.34倍；在200 mmol/L NaCl濃度下，脯氨酸在轉基因株系L2和L3中的含量分別是野生型植株的1.71和1.55倍，更有利于轉基因植株對鹽脅迫的適應(圖5)。

野生型和轉基因水稻的MDA含量在鹽脅迫處理前無顯著差異。隨著NaCl處理濃度的增加，所有植株MDA含量都有所增加，但轉基因水稻體內MDA含量都低于野生型植株。在200 mmol/L NaCl濃度下，野生型水稻的MDA含量增加了2.12倍，而轉基因水稻L2和L3的MDA含量分別增加了1.33和1.05倍，野生型水稻的MDA含量明顯高于轉基因水稻 (圖 5)。

2.5.2 鹽脅迫對水稻SOD、POD和CAT活性的影響

鹽脅迫處理前野生型和轉基因水稻SOD酶活性無顯著差異。隨著NaCl濃度的增加，野生型和轉基因水稻SOD酶活性在鹽脅迫下顯著增加。在200 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因水稻株系L2和L3的SOD酶活性分別是野生型水稻的1.95和1.75倍，說明鹽脅迫可以提高轉基因水稻SOD酶活性，加強了對活性氧的清除，降低對植物體的傷害(圖6)。鹽脅迫處理前野生型和轉基因水稻POD酶活性無顯著差異。隨著NaCl濃度的增加，野生型和轉基因水稻的POD活性迅速增加，并在100 mmol/L NaCl脅迫下達到最大值，然后降低。然而，轉基因水稻和野生型水稻之間的POD活性沒有顯著差異(圖6)。

鹽脅迫處理前野生型和轉基因水稻的CAT酶活性沒有顯著差異。不同濃度NaCl處理后，轉基因水稻CAT活性迅速增加，并在100 mmol/L NaCl脅迫下達到最大值。轉基因水稻株系L2的CAT酶活性從35.55上升至71.95 U/mg, FW，上升了1.02倍，L3的由40.91上升至68.18 U/mg, FW，上升了66.7%。然而，野生型水稻的CAT酶活性在不同的鹽脅迫下沒有顯著變化(圖6)。

圖 5 鹽脅迫對轉基因水稻脯氨酸和丙二醛含量的影響Fig. 5 Effects of salt stress on proline and MDA content in the transgenic rice

圖 6 不同濃度鹽脅迫轉基因水稻中SOD、POD和CAT的活性Fig. 6 Activities of SOD, POD and CAT in the transgenic rice under different salt stress concentrations

2.6 鹽脅迫對水稻脅迫相關基因表達的影響

為了揭示轉基因型水稻的耐鹽分子機制，采用實時熒光定量PCR分析在200 mmol/L的鹽脅迫下5個脅迫相關基因的表達模式。這5個脅迫相關基因分別是脯氨酸合成關鍵酶基因(OsP5CS1)、活性氧解毒酶基因(OsSOD、OsPOX1和OsCATB)以及逆境響應蛋白(OsLEA3)。結果表明，與野生型水稻相比，OsP5CS1、OsCATB、OsSOD和OsLEA3在轉基因水稻中的表達倍數顯著增加，而OsPOX1的表達倍數沒有明顯變化(圖7)。

圖 7 野生型(WT)和轉基因水稻株系(L2，L3)葉片脅迫應答基因在正常和鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)下表達的實時定量PCR分析Fig. 7 Quantitative real-time PCR analysis of stress responsive genes expression in the leaves of WT and transgenic plants (L2, L3) grown under H2O and stress of 200 mmol/L NaCl

3 討論與結論

土壤鹽漬化是影響植物生長發育和農作物產量的最重要的環境因子之一，通過基因工程改善作物的耐鹽性已受到廣泛關注[12]。過量表達TsIPK2可以增加轉基因油菜和大豆的耐鹽脅迫能力[9,11]。因此筆者認為鹽芥肌醇多磷酸激酶的表達可能賦予農作物的耐脅迫能力。

在本研究中，將TsIPK2基因轉入水稻，TsIPK2在脅迫下的表達模式類似于在鹽芥中的表達，TsIPK2mRNA在鹽處理1 h后累積，在脅迫3 h后表達量達到最大值，6 h后降低，表明在水稻中TsIPK2的表達受高鹽誘導(圖2)。正常生長環境條件下，TsIPK2過表達對轉基因水稻植株無顯著影響，在150 mmol/L NaCl的處理下，轉基因株系的發芽率均在60%以上，而野生型的發芽率在30%左右；在200 mmol/L NaCl處理下，轉基因水稻L2和L3株系的平均芽長比野生型分別高出8.2%和11.6%(圖3)，說明轉基因水稻具有較好的耐脅迫能力。

非生物脅迫引起植物葉片或根部細胞膜脂不飽和脂肪酸的過氧化作用，導致細胞膜透性的增加和抗氧化酶活性降低[13]，膜脂過氧化產物MDA含量的變化可以反映細胞膜系統的損傷程度[14]。在本研究中，隨著NaCl處理濃度的增加，野生型和轉基因水稻植株葉片MDA含量都有所增加，在200 mmol/L NaCl濃度下，野生型水稻的MDA含量增加了2.12倍，而轉基因水稻L2和L3的MDA含量分別增加了1.33和1.05倍，轉基因水稻體內MDA含量在鹽脅迫下的積累量明顯低于野生型植株(圖5)，說明轉TsIPK2基因水稻的膜脂過氧化程度較弱，細胞膜損傷較小。非生物脅迫如干旱、高溫、冷害和鹽堿等可誘發植物組織細胞內產生過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，但過多ROS的產生會導致植物細胞的死亡，因此植物建立抗氧化保護系統應對脅迫下ROS的過多積累[15]。超氧化物歧化酶(SOD)通過Harber-weiss循環催化歧化成O2和H2O2，產生的H2O2主要由過氧化氫酶(CAT)與過氧化物酶(POD)清除[16]。本研究中，野生型和轉基因水稻的POD酶活性在鹽脅迫下迅速增加，并在100 mmol/L NaCl脅迫下達到最大值，但轉基因水稻和野生型水稻中POD酶活性無顯著差異；在200 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因水稻L2和L3的SOD酶活性分別是野生型的1.95和1.75倍；在100 mmol/L NaCl脅迫下轉基因水稻L2和L3的CAT酶活性達到最大值，轉基因水稻L2和L3分別上升了1.02倍和66.7%，但野生型水稻的CAT活性沒有明顯變化(圖6)。脅迫產生的自由基在SOD和CAT兩者協調作用下維持在較低水平，從而減少膜的損傷，提高轉基因植株的耐逆性。

植物在受到非生物脅迫后通過調節逆境響應基因的表達，形成植物抗逆的分子機制，從而抵御非生物脅迫的影響[17]。本研究發現，在200 mmol/L的NaCl脅迫下轉基因水稻的活性氧解毒酶基因(OsCATB和OsSOD)的表達倍數顯著增加，與體內檢測到的抗氧化酶活性的結果一致(圖6、圖7)。在干旱、鹽漬等脅迫條件下，大量的游離脯氨酸作為細胞質滲透調節物質在植物中積累。OsP5CS1是脯氨酸合成的關鍵限速酶，OsP5CS1的表達受高鹽、干旱、冷脅迫和ABA處理的誘導，而不受熱處理誘導，在高鹽條件下，耐鹽品種中OsP5CS1的表達量比鹽敏感品種中的表達量高，從而積累更多的脯氨酸提高耐鹽性[18-20]。本研究表明，隨著鹽濃度的增加，野生型和轉基因水稻植株葉片脯氨酸含量增加，在200 mmol/L NaCl濃度下，轉基因株系L2和L3中脯氨酸的含量分別是野生型植株的1.71和1.55倍(圖5)，同時轉基因水稻株系中OsP5CS1的表達量顯著高于野生型水稻(圖7)，暗示轉入的TsIPK2基因在維持細胞內外的滲透平衡中發揮了一定作用。OsLEA3屬于LEA蛋白基因家族, 在逆境條件下能夠保護生物大分子及膜結構, 干旱、鹽和脫落酸等脅迫可誘導OsLEA3的表達[21]，轉TsIPK2基因水稻OsLEA3基因的表達量顯著增加有助于減輕因鹽脅迫脫水引起的離子強度增大對生物膜和功能蛋白的毒害，提高轉基因水稻的耐鹽性(圖7)。本研究結果證明TsIPK2基因可以影響轉基因水稻的脅迫耐受能力，有望通過轉基因技術提高該基因表達水平進而增強植物耐鹽能力。