敲低鈣調磷酸酶結合蛋白1引起腎小管上皮細胞線粒體損傷

吳汪麗 溫躍強

廣州醫科大學附屬第二醫院 (廣州 510260)

腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)損傷是腎臟疾病發生發展的重要因素。研究表明，血管緊張素II和TGF-β等因子引起RTECs慢性損傷，促進腎小管-間質纖維化，導致腎功能惡化和慢性腎臟病進展[1]。同時，線粒體功能障礙是RTECs損傷的關鍵環節。據報道，化療藥物等損傷因素通過降低RTECs線粒體膜電位和減少線粒體DNA復制，誘導RTECs產生線粒體自噬和凋亡[2]。鈣調磷酸酶結合蛋白1(calcineurin binding protein 1, Cabin1)廣泛存在于心、腦、肝等器官中，參與多種細胞功能的調節。我們的前期研究發現，Cabin1在足細胞和RTECs線粒體損傷時表達升高[3- 4]，但具體的分子機制尚未闡明。本研究旨在觀察敲低Cabin1對RTECs線粒體功能的影響，闡明其在RTECs線粒體損傷中的作用機制，以期為延緩腎臟纖維化提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 RTECs培養

采用質量濃度為100 g/L的胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2培養箱，培養大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E，中山六院姜宗培教授惠贈)。

1.2 采用siRNA敲低Cabin1的表達

待細胞長至80%左右匯合度時，用質量濃度為0.5 g/L的trypsin-EDTA消化傳代，并接種到6孔板中。待細胞匯合度達60%左右時，采用無血清的DMEM培養基培養12 h，使其生長同步化。進而將細胞分成3組： ①對照組： 采用無血清DMEM培養48 h；②陰性對照組： 采用陰性對照的siRNA轉染NRK-52E細胞，6 h后更換為無血清DMEM培養基，共培養48 h；③敲低組： 采用敲低Cabin1蛋白的siRNA(正義鏈： 5′-CCGGAGGAGAUAAAUCUAATT-3′；反義鏈： 5′-UUAGAUUUAUCUCCUCCGGTT-3′)(GenePharma, China)轉染NRK-52E細胞，6 h后更換為無血清DMEM培養基，共培養48 h。轉染試劑采用Lipofectamine?RNAiMAX(invitrogen,USA)，轉染過程按說明書進行。48 h后收集細胞，Western Blot檢測細胞中Cabin1蛋白表達。

1.3 WB檢測Cabin1蛋白的表達

取等量蛋白行電泳、轉膜、封閉，加入一抗(GAPDH, Kangchen, China ;Cabin1, Abcam, UK)4 ℃ 孵育過夜，接著用相應二抗(Anti-rabbit IgG, Cell Signaling Technology, USA)室溫孵育1 h，最后加入ECL發光試劑，曝光、顯影、定影，采用Image J圖像分析軟件進行分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 采用siRNA敲低RTECs中Cabin1蛋白表達

在正常對照組和陰性對照組，Cabin1蛋白在RTECs中具有高的表達，采用siRNA干預RTECs后，Cabin1蛋白的表達量較對照組和陰性對照組降低50%以上，見圖1。

與對照組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05。圖1 采用siRNA敲低RTECs中Cabin1蛋白表達

2.2 敲低RTECs中Cabin1引起線粒體形態學改變

對照組與陰性對照組細胞中，線粒體形態規則，呈圓形或橢圓形，線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見(白色箭頭所示)。敲低組細胞中，線粒體腫脹，呈長條形或不規則形，線粒體膜、線粒體嵴結構模糊甚至消失(白色箭頭所示)，見圖2。

圖2 敲低RTECs中Cabin1引起線粒體形態學改變

3 討 論

RTECs中富含線粒體，后者通過氧化磷酸化為前者提供ATP，供給細胞正常代謝的能量。線粒體功能障礙引起氧化應激和炎癥反應，誘導RTECs損傷，進而導致急慢性腎臟疾病的發生發展[5- 6]。本研究采用siRNA敲低RTECs中Cabin1表達，發現敲低Cabin1引起RTECs線粒體形態學改變，提示Cabin1與RTECs線粒體功能障礙密切相關。

我們的研究結果發現，敲低Cabin1引起RTECs線粒體呈長條形或不規則形，出現線粒體腫脹，線粒體膜、線粒體嵴結構模糊甚至消失。線粒體形態學的改變是線粒體功能障礙的重要指標，與腎臟細胞損傷密切相關[7]。研究者發現在阿霉素腎病大鼠模型中，模型組足細胞線粒體由圓形或橢圓形變成細長而不規則型[8]。此外，Gucer等在局灶性節段性腎小球硬化的患者腎組織中同樣發現足細胞線粒體的形態學改變[9]。因此，我們推斷Cabin1是維持RTECs線粒體正常功能的重要分子。

我們的前期研究發現AngII引起線粒體膜電位下調及細胞色素c蛋白的上調，同時Cabin1蛋白的表達明顯升高；敲低足細胞中Cabin1引起細胞骨架蛋白F-actin的破化和細胞色素c蛋白的高表達[3]。此外，我們的體內外研究，同樣證實Cabin1在RTECs線粒體損傷時表達升高[4]。我們的結果充分說明Cabin1是維持腎臟細胞線粒體功能的關鍵分子。那Cabin1通過什么具體的分子機制調控腎臟細胞線粒體功能呢？Cabin1通過調控p53參與多種細胞功能的調節，參與足細胞的損傷調節[10]。Peng[11]等認為p53的磷酸化引起Bax轉位到線粒體膜上，繼而加速細胞色素c自線粒體釋放到細胞漿，導致線粒體功能障礙。Cabin1在細胞受損時，通過調控p53的表達，穩定線粒體膜上的細胞色素c，維持線粒體的正常功能。Cabin1在RTECs損傷中的具體分子機制需要我們下一步的研究來證實。

綜上所述，本研究采用siRNA敲低RTECs中Cabin1表達，發現敲低Cabin1引起RTECs線粒體損傷，提示Cabin1是RTECs線粒體功能障礙的關鍵分子。但本研究尚未闡明Cabin1在RTECs線粒體損傷中的具體分子機制，將在下一步研究中深入探討。