斑馬魚石蠟組織切片技術的優化

劉承英 趙燕 劉娟

摘? 要：為優化斑馬魚（Danio rerio）石蠟切片制作技術，以斑馬魚心、腸、肝臟為材料，研究了斑馬魚石蠟組織的切片制作方法，并采集圖像進行分析。結果表明，改進后的實驗方法能夠制作出高質量的斑馬魚石蠟組織切片。

關鍵詞：斑馬魚;石蠟切片;蘇木精-伊紅染色;心臟

中圖分類號 Q95-3? ?文獻標識碼 A? ?文章編號 1007-7731（2019）09-0067-2

Abstract：To optimize the paraffin slicing technology of zebrafish （Danio rerio），Using zebrafish heart，intestine and liver as materials，the method of making paraffin tissue sections of zebrafish was studied，and image analysis was collected.The results showed the improved experimental method can produce high quality paraffin tissue sections of zebrafish.

Keywords：Zebrafish;Paraffin section;Hematoxylin-eosin staining;Heart

斑馬魚（Danio rerio）又名藍條魚、花條魚、斑馬擔尼魚，隸屬輻鰭亞綱鯉科短擔尼魚屬，是一種重要的脊椎動物模型，廣泛應用于發育生物學、遺傳學以及毒理學等多個研究領域[1-2]。目前，國內外關于斑馬魚正常組織結構的研究還較少，主要是關于斑馬魚端腦、中腦和腸道的組織結構的研究[3-5]，因而斑馬魚的組織結構基礎資料亟待完善。

石蠟組織切片能夠清晰顯示組織細胞的形態結構，提供基礎組織的形態學資料[6]。但是石蠟切片的制作步驟繁雜，影響因素多，因而摸索出一套制作高質量斑馬魚石蠟切片的方法尤為重要。本實驗以斑馬魚心、腸和肝臟為實驗材料，擬從浸蠟和染色步驟著手改進斑馬魚石蠟切片制作技術，以期為斑馬魚的組織學研究提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗材料 健康成年斑馬魚15尾，體長平均為（3.0±0.2）cm。

1.2 試劑與儀器 蘇木精（南京奧多福尼生物科技有限公司），伊紅（Y水溶，天津市大茂化學試劑廠），乙醇（分析純，南京華嘉化學試劑有限公司），二甲苯（分析純，廣州迪鑫多科學儀器有限公司）。2508型切片機（上海珂淮儀器有限公司），徠卡體視顯微鏡、徠卡DMI3000B型倒置熒光顯微鏡（上海立光精密儀器有限公司）。溶液配方：埃利希（Ehrlich）蘇木精（蘇木精1.0g、十二水硫酸鋁鉀2.5g、甘油50mL、無水酒精50mL、蒸餾水50mL、冰醋酸5mL）;磷鎢酸蘇木精（蘇木精0.1g，磷鎢酸2g，蒸餾水100mL）;中性甲醛溶液（40%甲醛50mL、無水磷酸氫二鈉3.25g、磷酸二氫鈉2.0g、蒸餾水450mL）。

2 實驗方法

2.1 取材 迅速在體視顯微鏡下解剖斑馬魚，取出器官后生理鹽水清洗2～3次，然后在中性甲醛溶液固定約24h。

2.2 石蠟切片制作

2.2.1 常規方法 將組織于70%乙醇分別沖洗3次，脫水和透明程序依次為70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇I，95%乙醇II，無水乙醇I，無水乙醇II各1h;無水乙醇∶二甲苯=1∶1，二甲苯I，二甲苯II各40min。

2.2.2 優化方法 在實驗過程中發現，不同浸蠟時間和不同配方蘇木精染液對實驗結果影響較大，參考常規方法進行了改進。浸蠟總時間設置了90min、120min、150min、180min4個梯度，蘇木精染色步先染液設置了埃利希（Ehrlich）蘇木精與磷鎢酸蘇木精對比實驗。

2.2.3 圖像采集 取上述中性甲醛的斑馬魚器官，石蠟包埋后進行連續切片（厚度為4um），染色后中性樹膠封固，在徠卡倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

3 結果與分析

3.1 浸蠟的影響 充分浸蠟，可以保證切片時組織的完整性，浸蠟是否充分主要與處理時間有關。浸蠟程序一般為石蠟（I）、石蠟（II）和石蠟（III）總共1～3h，實驗研究中設計了4個梯度時間方案（表1）。結果顯示，浸蠟總時間為90min時，斑馬魚心臟和腸組織內部均不能充分浸蠟，制片后心肌組織結構出現較多空洞（圖1A），腸組織明顯斷裂（圖1B）;浸蠟總時間延長為120min時，心臟結構比較完整清晰，但是心臟組織結構仍較多斷裂（圖1C），腸組織結構有少部分斷裂（圖1D）;當浸蠟時間延長至150min時，保證了充分浸蠟，斑馬魚心臟和腸組織結構最完整清晰（圖1E和圖1F）;當浸蠟時間延長至180min時，雖然保證了充分浸蠟，但是制片觀察發現斑馬魚石蠟切片較厚，心臟和腸組織結構都不清晰（圖1G和圖1H）。

3.2 蘇木精染色液的影響 蘇木精-伊紅染色法是制作石蠟切片時常用的染色方法，當染色時間同設為30min時，埃利希（Ehrlich）蘇木精與磷鎢酸蘇木精的染色結果顯示，埃利希蘇木精染色后斑馬魚肝臟細胞輪廓不明顯（圖2A），使用磷鎢酸蘇木精染色后斑馬魚肝臟組織切片中明顯可見肝細胞呈圓形，細胞核居中，多為1個（圖2B），可見使用磷鎢酸作為媒染劑時細胞著色更加清晰。

4 結論

斑馬魚體型較小，器官多柔軟且小，充分浸蠟可以保證切片的完整性。浸蠟溫度以石蠟剛剛溶化為好，當浸蠟時間為150min時，組織可以充分浸蠟，組織結構最完整;而時間較短時，組織易斷裂。蘇木精染色效果較為關鍵，以磷鎢酸為媒染劑的蘇木精配方染色，斑馬魚肝細胞形態更加清晰，細胞核也明顯可見。

參考文獻

[1]賈順姬，孟安明.中國斑馬魚研究發展歷程及現狀[J].遺傳，2012，34（9）：1082-1088.

[2]何嘉玲，劉靜，王天奇，等.斑馬魚的質量標準化[J].中國實驗動物學報，2014，22（6）：99-102.

[3]陳微，章琳俐，楊平，等.斑馬魚端腦的微細形態與結構[J].水產學報，2015，39（3）：371-380.

[4]陳微，章琳俐，劉儀，等.斑馬魚中腦微細結構及相關免疫組化反應[J].畜牧與獸醫，2015，47（12）：89-93.

[5]林金杏，章琳俐，姚一琳，等.斑馬魚腸道顯微和超微結構的研究[J].畜牧與獸醫，2013，45（3）：60-66.

[6]鄭偉，嚴繼舟.斑馬魚組織石蠟切片質量的優化[J].江蘇農業科學，2013，41（11）：260-263.

（責編：張宏民）