黃蜀葵花總黃酮提取物中鞣質的含量測定

張清華，崔 燕

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic的干燥花冠。味甘，性寒，歸腎、膀胱經。具有清利濕熱、消腫解毒的功效。用于濕熱壅遏，淋濁水腫；外治癰疽腫毒，水火燙傷[1]。黃蜀葵花在我國用藥歷史悠久，始載于宋代掌禹錫所著《嘉佑本草》，其后歷代本草均有記載。《嘉佑本草》記載黃蜀葵花“甘、寒、滑、無毒，主治小便淋及催生，治諸惡瘡、膿水久不痤者，作末敷之即愈，為瘡家要藥”。《本草綱目》記載：“其花氣味甘、寒、滑，無毒，主治小便淋及催生，消癰腫，浸油涂湯火傷”。現代藥理學研究證明，黃蜀葵花中總黃酮具明顯的抗炎、抑菌、鎮痛、抗病毒及促進愈合等藥理作用[2-7]，并可通過抑制心肌脂質過氧化、抑制心肌炎癥反應，對缺血再灌注損傷的心肌發揮保護作用[8]。

由于鞣質與黃酮類物質存在天然的生源關系，部分鞣質具有與黃酮相似的結構[9]，在黃蜀葵花總黃酮提取純化的過程中鞣質類成分也會有所富集。目前，針對黃蜀葵花及其提取物的質量研究多集中于黃酮類成分的控制，有關黃蜀葵花總黃酮中鞣質類成分的測定迄今未見報道。根據《藥品注冊管理辦法》中規定，藥材提取的有效部位制成的制劑要求“主要成分必須基本清楚”，為此，我們對黃蜀葵花有效部位總黃酮提取物的化學成分進行了較深入的研究，建立了提取物中鞣質的含量測定方法，保證了黃蜀葵花總黃酮的質量，為其進一步研究和開發提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 8453紫外-可見分光光度計（安捷倫科技公司）；KQ2200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；XS-205電子天平（美國梅特勒-托利多公司）。

1.2 材料

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-200302）；黃蜀葵花總黃酮提取物（自制，批號：20090227，20090313，20091212）；干酪素，無水碳酸鈉，福林酚試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品約5 mg，精密稱定，置10 ml棕色量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 ml中含沒食子酸0.1 mg）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花總黃酮提取物約10 mg，精密稱定，置25 ml棕色量瓶中，加70 %乙醇約20 ml，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加70 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總酚供試品溶液的制備 取上述供試品溶液4 ml，離心（7000 r/min）10 min，取上清，即得。

2.1.4 不被吸附的多酚供試品溶液的制備 精密量取上述供試品溶液20 ml，加至已盛有干酪素0.6 g的100 ml具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，備用。

2.1.5 干酪素溶液的制備 取干酪素粉末0.6 g，置100 ml具塞錐形瓶中，加入70 %乙醇20 ml，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，備用。

2.2 吸收波長的選擇

精密量取沒食子酸對照品溶液0.5 ml，總酚供試品溶液和不被吸附的多酚供試品溶液各0.2 ml，干酪素溶液0.4 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，分別加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。在400～900 nm波長范圍內掃描，結果顯示，4種反應液均在752±2 nm處有最大吸收，表明沒食子酸、鞣質類成分顯色后的產物有相同的吸收峰，故確定以752 nm為測定波長。

2.3 標準曲線的繪制

精密量取沒食子酸對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，分別加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應溶劑為空白，在波長752 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標（y），對照品濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=0.193 76x-8.6843×10-3（r=0.9996）。結果表明，沒食子酸在9.76×10-4～9.76×10-3mg/ml濃度范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗

精密量取沒食子酸對照品溶液（0.1 mg/ml）0.4 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應溶劑為空白，在波長752 nm處測定吸光度，重復測定6次，測得沒食子酸吸光度的RSD為0.23 %。結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密量取總酚供試品溶液及不被吸附的多酚供試品溶液各0.2 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應溶劑為空白，分別于配制后室溫下放置0，30，60，90，120，180 min時，在752 nm處測定吸光度，測得吸光度的RSD分別為0.52 %，0.75 %（n=6）。結果表明，顯色后的總酚供試品溶液及不被吸附的多酚供試品溶液在180 min內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

2.6.1 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花總黃酮提取物（批號20091212）約10 mg，共6份，分別精密稱定，按2.1.2項方法制備供試品溶液。

2.6.2 總酚的測定 分別取上述供試品溶液4 ml，離心（7000 r/min）10 min，精密量取上清0.2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應溶劑為空白，在752 nm處測定吸光度，按沒食子酸標準曲線計算總酚量。

2.6.3 不被吸附的多酚的測定 分別精密量取上述供試品溶液20 ml，加至已盛有干酪素0.6 g的100 ml具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，分別精密量取續濾液0.2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以干酪素溶液為空白，在752 nm處測定吸光度，按沒食子酸標準曲線計算不被吸附的多酚量。

2.6.4 鞣質含量計算 鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量，得樣品中鞣質的平均含量為12.86 %，RSD為3.06 %（n=6）。結果表明本法具有較好的重復性。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的黃蜀葵花總黃酮提取物（鞣質含量為12.86 %）5份，各約20 mg，精密稱定，置100 ml棕色量瓶中，分別加入已精密稱定的沒食子酸對照品約2 mg，加入70 %乙醇約70 ml，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加70 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按2.6.2項方法測定總酚量；按2.6.3項方法測定不被吸附的多酚量；按2.6.4項方法計算鞣質含量，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.8 3批黃蜀葵花總黃酮提取物鞣質含量測定

取3批黃蜀葵花總黃酮提取物（批號：20090227，20090313，20091212），按2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.6.2項方法測定總酚量；按2.6.3項方法測定不被吸附的多酚量；按2.6.4項方法計算鞣質含量，3批樣品的鞣質含量分別為13.03 %，14.37 %，12.58 %。

3 討論

3.1 本研究方法測定原理為酚類物質在堿性溶液中可將福林酚試劑中的鎢鉬酸還原（W6+變為W5+），生產藍色化合物，顏色的深淺與酚含量成正相關[10]。因此可采用沒食子酸為對照品，福林酚試劑顯色，紫外可見分光光度法測定總酚含量；用干酪素沉淀鞣質，再以福林酚試劑顯色，測定不被吸附的酚類物質含量，二者之差即為鞣質含量。

3.2 藥典中鞣質含量測定采用磷鉬鎢酸試劑[1]，本研究采用福林酚試劑代替磷鉬鎢酸試劑，彌補了磷鉬鎢酸試劑配制過程較麻煩，花費時間長，且其他還原性性物質有干擾的不足。實驗結果表明，采用福林酚/干酪素法測定黃蜀葵花總黃酮中鞣質含量結果穩定，操作簡便，重現性好，且具有良好的精密度和準確性，可用于黃蜀葵花總黃酮中鞣質的含量測定，保證黃蜀葵花總黃酮的質量。