雙氯芬酸鈉大鼠在體腸吸收的研究

石英杰 王銳利 張麗鋒 任國蓮 張淑秋*

（山西醫科大學藥學院臨床藥學教研室，山西 太原 030001）

雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DS）為鄰氨基苯甲酸衍生物[1]，在臨床上用于緩解急慢性關節炎、急慢性強直性脊柱炎、肩周炎、滑囊炎、急性的輕、中度疼痛及各種原因引起的發熱等。該藥在體內的半衰期短[2]（t1/2約1.5 h），血藥濃度低，須頻繁給藥，因此研究和開發其緩釋制劑更符合臨床治療的要求。

在進行藥物處方研究時，可以藥物腸道吸收特征為指導。本文采用在體單灌流法研究雙氯芬酸鈉的腸吸收動力學特征，闡述其可能的吸收機制，以期為藥物的處方設計提供生物藥劑學依據。

1 材 料

試劑：雙氯芬酸鈉（寧波斯邁克制藥有限公司、批號：DOSR-1504015）；烏來糖（批號1203147，上海展云化工有限公司）；乙腈、甲醇（天津市科盟化工工貿有限公司、色譜純）；其他試劑均為分析純。

儀器：Agilent1200 高效液相色譜系統（美國安捷倫公司），FA1104N 電子天平，HH-2數顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學儀器廠），HL-2S恒流泵（上海嘉鵬科技有限公司）。

動物：健康雄性Wistar大鼠，重量（230±20）g（山西醫科大學實驗動物中心提供）。

灌流液：Krebs-Ringer 試劑：稱取NaCl 7.8 g、NaHCO31.37 g、KCl 0.35 g、NaH2PO40.32 g、CaCl20.37 g，MgCl20.02 g、葡萄糖1.48g加蒸餾水至1000 mL，調節pH至7.4。

2 方法與結果

2.1 灌流液中藥物的方法學考察

2.1.1 色譜條件：色譜柱：Aglient HC-C8（4.6 mm×250 mm，5 L），流動相：乙腈-0.4%乙酸銨溶液-三乙胺（45∶55∶0.2），流速：0.7 mL/min，檢測波長：275 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：20 L。tR為6.9 min。

2.1.2 專屬性考察：用新配制的Krebs-Ringer液對小腸灌流。按“2.1.1”項下色譜條件操作，考察方法專屬性，結果見圖1，表明雙氯芬酸鈉在該方法下專屬性較好。

圖1 腸灌流液的色譜圖：A-空白灌流液；B-含藥灌流液；1-雙氯芬酸鈉

2.1.3 線性關系實驗：精密稱取約10 mg雙氯芬酸鈉用100 mL空白灌流液定容，配制成質量溶度為100 g/mL的溶液，分別移取該溶液適量于10 mL的容量瓶中，配制成質量濃度為1、5、10、15、25 g/mL的系列標準溶液，進樣量為20 L，記錄雙氯芬酸鈉峰面積，繪制標準曲線，得方程：A=68.021C+20.41（R2=0.9998，n=5）。結果表明：雙氯芬酸鈉在1～25 g/mL的范圍內，有較好的線性關系。

2.1.4 方法的精密度試驗：用空白灌流液分別配制質量濃度為5、10、15 g/mL的雙氯芬酸鈉溶液，3種質量濃度的溶液分別在1 d內重復進樣6次得日內精密度，3種溶液每天進樣1次，連續進樣3 d得日間精密度，低（5 g/mL）、中（10 g/mL）、高（15 g/mL）3個質量濃度的日內精密度RSD分別為0.13%、0.06%、0.09%，日間精密度RSD分別為0.84%、0.61%、0.75%。可說明該方法精密度良好。

2.1.5 準確度試驗：用配制好的質量濃度為5、10、15 g/mL的雙氯芬酸鈉溶液，以“2.1.1”項下條件操作，記錄峰面積，求得雙氯芬酸鈉的回收率；結果表明雙氯芬酸鈉在上述低、中、高3種質量濃度下回收率結果分別為（100.67±1.62）%、（99.0±1.71）%、（99.51±0.60）%，結果表明該測定方法準確。

2.1.6 藥物的穩定性試驗：用Krebs-Ringer液對各腸段灌流，收集流出液，以此流出液配制含藥濃度為10 g/mL的溶液，置于37 ℃的水浴中，每30 min取樣1次，共取樣6次，持續180 min，求得雙氯芬酸鈉的濃度，計算其相對標準偏差（RSD），RSD≤2%，表明雙氯芬酸鈉在灌流液中至少可以穩定3 h。

2.2 大鼠在體腸吸收實驗[3-5]：將實驗前禁食12 h、體質量約250 g的大鼠用0.2 g/mL的烏拉坦進行腹腔注射麻醉（0.8 g/kg），并固定于手術板上。沿腹中線剪開大鼠腹腔（約3 cm），膽總管插管引流膽汁，找出待考察腸段，在該腸段的上下兩端各切一小口，插入直徑約為0.3 cm的玻璃管，用手術線扎緊，用預熱至37 ℃的生理鹽水將小腸內容物沖洗干凈。用浸有生理鹽水的紗布將傷口覆蓋保濕（實驗過程中不停的滴加預熱置37 ℃的生理鹽水），用紅外燈照射為大鼠取暖，以維持大鼠體溫。

將含藥 K-R液，預熱至37 ℃，以1 mL/min灌流腸段20 min，然后將流速降至0.2 mL/min，并以此流速維持30 min使吸收達到平穩，輸入端用裝有含藥K-R液的EP管（質量已稱）灌入，輸出端用空EP管（質量已稱）接收，每間隔15 min迅速替換掉供藥的EP管和收集的EP管，并稱重，計算供藥EP管與收集EP管各自的質量差值，于計時后2 h停止采集灌流液，共收集7~8個點，灌流結束后將大鼠處死，將灌流的腸段取出，沖洗干凈后剪開，置于坐標紙上，測量其長度和內徑。

實驗考察的大鼠腸段的選擇如下；十二指腸段自幽門1 cm處開始，空腸段自幽門15 cm處開始，回腸段自盲腸上行20 cm處開始，結腸段緊鄰盲腸至直腸，各待測腸段截取長度約為10 cm。

2.3 數據處理：采用重量法[6-7]按以下公式計算藥物吸收速率常數（Ka）和表觀吸收系數（Papp）：

Qin和Qout分別為灌入液和收集液的體積（mL，根據測得質量按密度為1折算成體積）；Cin和Cout分別為腸道輸入端和輸出端灌流液中藥物的質量濃度（μg/mL）；r為待考察腸段的內徑半徑；l為待考察腸段的長度； Q為灌流體積流量；V （mL，V=πr2l ）為灌流腸段的體積。

實驗結果采用SPSS16.0軟件進行方差分析（ANOVA），其中組間差異經SNK-q檢驗分析，結果以（-x±s）表示，判據為當P<0.05時結果具有顯著性差異，當P>0.05時結果沒有顯著性差異。

2.4 結果

2.4.1 雙氯芬酸鈉以不同質量濃度灌流小腸考察腸的吸收動力學：分別用不同質量濃度的雙氯芬酸鈉灌流液對大鼠小腸進行灌流，比較雙氯芬酸鈉供試液在不同濃度條件下的Ka和Papp值，結果見表1。經SNK-q檢驗分析可知，雙氯芬酸鈉在實驗濃度范圍內的小腸吸收參數Ka和Papp差異均無統計學意義（P＞0.05）。雙氯芬酸在5~20 g/mL濃度范圍內的小腸吸收無濃度依賴性，說明主要以被動擴散機制吸收進入體循環。

表1 不同濃度的雙氯芬酸鈉的吸收參數（n = 5，±s）

表1 不同濃度的雙氯芬酸鈉的吸收參數（n = 5，±s）

C(g/mL) Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)5 4.56±0.18 6.36±0.011 10 4.32±0.15 6.20±0.072 20 4.76±0.21 6.92±0.092

2.4.2 雙氯芬酸鈉以同一質量濃度灌流大鼠不同腸段考察腸的吸收動力學：灌流液的質量濃度為10 g/mL，待測腸段的選擇如“2.2項下”所述，以同一質量濃度灌流不同腸段，比較不同腸段的Ka和Papp值。結果見表2，經SNK-q檢驗分析可知，除回腸的Ka、Papp值與十二指腸、空腸和結腸之間存在顯著性差異（P<0.05）外，其他各組之間比較均沒有顯著性差異。表明藥物吸收最快的部位是回腸，其次是空腸、結腸、十二指腸。不同腸段的吸收趨勢為：回腸＞空腸＞結腸≈十二指腸。Papp值均＞1.2 ×10-3cm/s1，表明雙氯芬酸鈉在小腸全段的吸收均較好[8-9]。

表2 雙氯芬酸鈉在不同腸段的吸收參數（n = 5，±s）

表2 雙氯芬酸鈉在不同腸段的吸收參數（n = 5，±s）

注：與回腸組比較，1)P<0.05

Intestine Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)Duodenum 5.28±0.681) 2.86±0.331)Jejunum 6.42±0.951) 6.34±0.32 Ileum 8.47±0.69 6.73±0.27 Colon 5.89±0.511) 5.40±0.571)

2.4.3 雙氯芬酸鈉以不同灌流體積流量灌流小腸考察腸的吸收動力學：以同一質量濃度的含藥灌流液（10 g/mL），以不同的灌流速度（0.2、0.4、0.8 mL/min）對大鼠小腸進行灌流。比較不同灌流速度下藥物的Ka和Papp值。見表3，結果表明：經SNK-q檢驗分析可知，在各體積流量下的Ka和Papp比較差異均顯著（P＜0.05），利用灌流體積流量的改變來模擬小腸不同的運動狀態，本實驗說明小腸在不同的運動狀態下對雙氯芬酸鈉的吸收產生一定的影響。

表3 雙氯芬酸鈉在不同體積流量下的吸收參數（n = 5，±s）

表3 雙氯芬酸鈉在不同體積流量下的吸收參數（n = 5，±s）

注：與體積流量（0.2 mL/min）組相比較，1)P<0.05；與體積流量（0.4 mL/min）組相比較，2)P<0.05

perfusion(mL/min) Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)0.2 4.32±0.152) 6.20±0.0722)0.4 5.88±0.141) 8.56±0.0741)0.8 6.92±0.181)2) 9.22±0.0581)

3 討 論

3.1 用于評價藥物腸道吸收情況的動物模型有很多，目前常用的方法主要有“在體循環法”和“單向灌流法”。在體循環法中較高的灌流速度，可引起腸黏膜的脫落，造成損傷，而較長的灌流時間，會影響藥物的代謝，更有可能導致一些藥物的降解，現已較少應用。相比之下，單向灌流法灌流速度低（約0.2 mL/min），灌流時間短，并且與給藥后藥物接觸腸道的環境較為接近。因此為提高實驗測定的準確度。本實驗采用了“單向灌流法”評價雙氯芬酸鈉在腸道的吸收情況。

3.2 大鼠在體腸吸收實驗過程中腸道對水分的吸收或分泌會對實驗測定產生一定的影響，因此需要校正灌流液的體積，以保證實驗結果的準確性。目前多采用的方法有酚紅法與重量法，然而在灌流過程中酚紅可能會被腸道吸收，并且還可能影響腸道的吸收環境。因此本實驗引入重量法進行灌流液的體積校正，本法操作簡單，并且可以較真實客觀地反映腸道水分吸收情況。

3.3 由于大鼠的生理結構中的輸膽總管開口于十二指腸的上端，分泌的膽汁直接進入十二指腸。膽汁的成分很復雜，其中的有機成分膽鹽、膽固醇和卵磷脂具有乳化劑的作用，可影響一些藥物的代謝[10]。同時進入十二指腸內的膽汁可通過腸肝循環影響腸道中的藥物濃度。因此為排除膽汁因素對藥物測定的影響，本實驗將膽汁引流，以確保實驗結果的準確性。

3.4 一般認為大鼠小腸全腸段的Papp＜1.8×10-4cm/min，或Papp＞1.2×10-3cm/min時，表明藥物難吸收或完全吸收。本實驗結果雙氯芬酸鈉的有效滲透吸收順序為：空腸≈回腸＞結腸＞十二指腸。根據以上標準，說明雙氯芬酸鈉在大鼠各腸段均有較好吸收，適于制備成緩釋給藥系統。