賴氨大黃酸與大黃酸對大鼠膽汁淤積性肝纖維化的療效比較

孔藝璇 劉章心怡 張榮花 王 琳 衛敬澤 甄永占 章廣玲,*

（1 華北理工大學基礎醫學院病原生物學與免疫學教研室，河北 唐山063000；2 中南大學湘雅醫學院，湖南 長沙 410013；3 華北理工大學基礎醫學院 河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北 唐山 063000）

肝纖維化是指細胞外基質的合成和降解的不平衡導致肝臟纖維結締組織過度沉積，是多種原因引起的慢性肝病向肝硬化發展所經歷共有的病理改變和必經途徑[1]。目前研究表明，進行抗纖維化治療可以顯著降低肝纖維化程度，可以逆轉肝纖維化[2]。大黃酸（Rhein）是一種蒽醌類化合物，是大黃、何首烏、虎杖等傳統中藥的主要有效成分之一。研究表明大黃酸除具有抑制腫瘤細胞增殖[3-4]、抗炎[5]、抗菌及調節腎功能等功效，還具有保肝和抗肝纖維化的藥理作用[6]，然而，水溶性較差的大黃酸，限制其進一步應用，為改善其水溶性，以賴氨酸作為溶劑對大黃酸的結構進行改造獲得水溶性較好的賴氨大黃酸。本研究采用膽總管結扎法建立大鼠肝纖維化模型，形成人為的肝外膽道梗阻，膽汁排泄障礙導致以膠原為主的細胞外基質成分合成增多，過多沉積在肝內竇周間隙形成肝纖維化[7]。此模型與CCL4和DMN等藥物所致化學損傷動物模型[8]相比有顯著差異，成模時間短且肝實質細胞無明顯壞死[9]，對抗肝纖維化研究中具有重要意義。本研究旨在比較RHL和大黃酸防治BDL肝纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器：由天津實驗動物研究所提供SD大鼠，雄性，在22 ℃恒溫、65%~70%的相對濕度環境中飼養適應2 d后進行實驗。賴氨大黃酸自制，純度98%，相對分子質量：430，室溫儲存； ALT、AST、TBA、TBIL試劑盒，HE染色試劑盒，Masson 染色試劑盒，羥脯氨酸試劑盒購，RIPA裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒，α-SMA抗體，GAPDH一抗抗體、羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗，免疫組化試劑盒；F6/10-8G型FLUKO 超細勻漿機，5810R低溫高速離心機，Gemini EM熒光讀板機，BX63全自動顯微鏡掃描系統，電泳轉印系統、凝膠成像系統，Rayto chemray 240全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型的建立：用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射進行麻醉，解剖，在肝臟和十二指腸連接處找到膽總管，進行分離，分別結扎膽總管近端和遠端，從中間剪斷后關腹。假手術對照組剪開腹腔后隨即關腹。

1.2.2 動物分組及處理：按動物體質量進行分層隨機分為賴氨酸組、RHL 70 mg/（kg?d） 治療組、70 mg/（kg?d） 大黃酸組、模型組、對照組，每組4只。以灌胃的方法給藥，對照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。所有實驗大鼠在實驗期間自由飲食、飲水。

1.2.3 收集標本：藥物治療2周后收集標本，術前大鼠空腹8 h，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，在開腹后采集腹主動脈的血液標本2~3 mL，3000 r/min離心10 min，留取上層血清保存在-80 ℃冰箱待測ALT、AST、TBA、TBIL。留取大鼠肝臟組織，在冰上進行操作，用在4 ℃預冷的0.9%生理鹽水反復沖洗，縱切取3~4 mm厚的肝大葉中央部位的肝組織，10%中性甲醛固定。

1.2.4 血清生化指標檢測：全自動生化分析儀進行血清學指標檢測，采用酶動力學法測定ALT、AST，采用循環酶法測定TBA，采用偶氮反應法測定TBIL。

1.2.5 肝組織病理學檢測：肝臟組織在10%中性甲醛中固定12 h以上，石蠟包埋，切片（厚度3 μm）做HE、Masson染色，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.6 肝組織Hyp含量測定：大鼠肝組織中Hyp含量嚴格按照試劑盒的說明書操作，采用樣本堿水解法進行測定。

1.2.7 肝組織免疫組織化學染色（SP法）：肝臟組織在10%中性甲醛中固定12 h以上，石蠟包埋，切片（厚度3 μm）。抗原修復，SP 法免疫組織化學染色，DAB 顯色，用蘇木素復染細胞核。陽性對照使用已知陽性切片，陰性對照使用PBS 代替一抗。細胞核或細胞質出現棕黃色顆粒為陽性結果，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.8 Western blotting 分析：RIPA裂解液提肝臟組織蛋白。12% SDSPAGE電泳將等量蛋白分離后，電轉移至PVDF膜上，封閉2 h，加入抗α-SMA（1∶500），GAPDH（1∶1000）作為內參，4 ℃過夜，洗膜，加二抗（1∶5000）孵育2 h，洗膜，按照1∶1混合適量的化學發光增強劑A液和B液，滴加在膜上（BeyotimeECL Plus），凝膠成像儀對各條帶灰度值進行掃描并分析結果。

表 1 各組大鼠生長率、肝臟與體質量比和血清生化檢測結果（n=4，±s）

表 1 各組大鼠生長率、肝臟與體質量比和血清生化檢測結果（n=4，±s）

注：aP<0.05，與假手術組相比；bP<0.05，與模型組相比；cP<0.05，與大黃酸組相比

組別 生長率(daily%) 肝臟/體質量(g/kg) ALT(U/L) AST(U/L) TBA(μmol/L) TBIL(μmol/L)賴氨酸 0.27±0.13 57.82±5.97 157.00±8.48 1263.00±103.41 177.33±22.37 163.39±14.91 RHL組 0.34±0.52 46.25±2.64 b 76.25±6.08 bc 822.25±80.40 bc 116.70±5.34 b 90.59±18.31 bc大黃酸 0.30±0.15 56.05±4.48 120.25±8.54 b 1270.75±70.11 153.53±16.70 151.17±18.89 b模型組 0.27±0.07 61.17±2.50 a 207.75±23.61 a 1348.50±72.45 a 197.67±12.13 a 178.51±14.15 a假手術 0.43±0.07 26.07±1.75 31.50±8.06 132.25±4.35 9.37±1.23 0

2 結 果

2.1 各組大鼠生長率、肝臟與體質量比和血清生化檢測結果：與對照組相比，模型組大鼠生長率下降，差異不具有統計學意（P>0.05），肝臟濕重與體質量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，RHL組大鼠生長率上升，差異不具有統計學意（P>0.05），肝臟濕重與體質量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05）；大黃酸組大鼠生長率下降，差異不具有統計學意（P>0.05），肝臟濕重與體質量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯降低，僅ALT、TBIL 差異具有統計學意義（P<0.05）；賴氨酸組大鼠生長率、肝臟濕重與體質量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL無明顯下降，差異不具有統計學意義（P>0.05）。與大黃酸組比較，RHL 組大鼠生長率上升，差異不具有統計學意（P>0.05），肝臟濕重與體質量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯降低，僅ALT、AST、TBIL差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學改變：通過HE 染色結果顯示，對照組大鼠肝細胞排列整齊有規則，可見完整肝小葉結構，竇周間隙無膠原纖維增生；與對照組相比，模型組大鼠肝細胞排列紊亂，肝小葉結構被破壞，并伴有匯管區大量纖維組織異常增生，增生的纖維組織呈寬帶狀伸展；賴氨酸組與模型組非常相似；各治療組大鼠肝細胞紊亂，但仍可見肝小葉結構，只有部分肝小葉結構被破壞，匯管區有中等量纖維增生，并呈細帶狀向周圍伸展；與大黃酸組相比，RHL組肝細胞排列較整齊，匯管區增生的纖維組織較少。見圖1。

圖1 HE 染色檢測膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟組織病理改變（×200）

2.3 各組大鼠肝臟組織纖維成分分布情況：Masson 染色顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝臟組織中纖維含量顯著增多；與模型組相比，經RHL和大黃酸治療后，大鼠肝臟組織中纖維含量顯著減少，且RHL組較大黃酸組纖維含量降低更顯著，見圖2。

2.4 各組大鼠肝臟組織中Hyp含量：與對照組相比，模型組大鼠肝臟組織中Hyp含量明顯增加（P<0.05）；與模型組相比，治療后大鼠肝組織中Hyp含量明顯減少，賴氨酸組無明顯差異（P >0.05），與大黃酸組相比，RHL組Hyp含量減少，差異有統計學意義（P<0.05），見圖3。

圖2 Masson三色染色檢測膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟組織纖維分布（×200）

圖3 各組大鼠肝組織Hyp含量

2.5 各組大鼠肝臟組織切片α-SMA免疫組織化學染色結果：免疫組化染色顯示，α-SMA在細胞膜和細胞質中分布。對照組α-SMA少量表達在血管周圍；模型組α-SMA大量在匯管區和纖維間隔表達，治療組可見均少量表達在纖維隔及匯管區且大黃酸組較RHL組表達量大，見圖4。

圖4 免疫組織化學染色檢測α-SMA在膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟組織中的分布（×200）

2.6 Western blot 檢測α-SMA 的表達：與對照組相比，模型組大鼠α-SMA的表達顯著增加；與模型組相比，治療組大鼠α-SMA的表達顯著減少（P<0.05），賴氨酸組無顯著改變（P>0.05），與大黃酸組相比，RHL組α-SMA的表達顯著減少（P<0.05），見圖5。

圖5 Western blot 檢測α-SMA的表達

3 討 論

肝纖維化是機體對慢性肝損傷的主動性修復反應，其特征在于肝臟細胞外基質（ECM）的異常增生和沉積，表現為肝竇毛細血管化與肝小葉內纖維化形態特征[8-9]。肝纖維化并不是一種獨立的疾病，其是各種慢性肝病向肝硬化及肝癌等發展的必然病理過程。本研究結果顯示，BDL模型組大鼠生長率降低、肝臟與體質量比升高，生化檢測分析ALT、AST、TBA TBIL顯著升高，HE 染色未見完整肝小葉，肝細胞排列無規則，并伴有纖維組織異常增生，提示BDL模型復制成功[10]。

在膽汁瘀積性肝纖維化形成過程中ECM異常增生與沉積是最關鍵環節。HE染色提示，各治療組可見肝小葉結構，與大黃酸組相比，RHL的治療使肝細胞排列較整齊，匯管區增生的纖維組織較少。Masson 染色進一步提示治療組大鼠肝臟組織中纖維含量降低且RHL組纖維含量低于大黃酸組。此外，由于Hyp是膠原纖維獨有的氨基酸，動物肝組織中羥脯氨酸含量與肝纖維化程度呈正相關[11]，本研究中與模型組相比，各治療組大鼠肝組織中Hyp含量顯著減少，RHL組低于大黃酸組。上述病理改變證實了賴氨大黃酸和大黃酸均能夠減輕肝纖維化程度，減少ECM的異常增生和過度沉積，且賴氨大黃酸的作用優于大黃酸。

此外，血清學指標檢測顯示，與模型組相比，RHL組大鼠的ALT、AST、TBA、TBIL顯著降低，大黃酸組僅ALT、TBIL顯著降低，提示RHL和大黃酸能較好地保護肝臟，改善肝功能；與大黃酸組相比，RHL組大鼠ALT、AST、TBIL指標降低，提示賴氨大黃酸的保肝作用優于大黃酸。

為了進一步研究RHL和大黃酸在預防和治療膽汁淤積性肝纖維化中的作用，本實驗檢測α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的分布和表達變化。研究表明，肝星狀細胞的激活是肝纖維化發生的中心環節，肝臟ECM的產生主要細胞來源是HSC[12]。HSC在正常情況下處于靜息狀態，在受到損傷后HSC被活化，表達α-SMA作為細胞活化標志，并轉化成肌成纖維樣細胞，增強纖維的形成[13]，α-SMA表達量的大小與HSC的激活程度呈正比。本研究結果顯示，α-SMA廣泛分布于肝細胞胞膜和胞質；與模型組相比，RHL組和大黃酸組大鼠肝組織α- SMA的表達均下降，且RHL組的表達量低于大黃酸組，提示RHL和大黃酸能夠抑制HSC的激活，且RHL作用優于大黃酸。

綜上所述，RHL和大黃酸通過對HSC激活的抑制，降低HSC活化的數量，減少ECM異常增生與沉積，而達到保護肝臟和治療肝纖維化作用，并且RHL對肝纖維化的療效優于大黃酸。