黃芪多糖對LPS誘導的THP-1源巨噬細胞產生細胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的影響*

費煜暢 鄭戴波 潘 磊 陳培豐#

1 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫院 浙江 杭州 310006

黃芪多糖（APS）作為黃芪主要的抗癌成分之一，較多研究已表明其在抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管生成等方面發揮作用，且可調節機體免疫水平[1-3]。基于APS在這些方面的研究，本實驗通過觀察不同濃度APS及不同作用時間下脂多糖（LPS）誘導的THP-1源巨噬細胞存活率和產生IL-10、IL-12、TNF-α的表達量，探討APS對THP-1源巨噬細胞免疫功能的影響，為進一步研究黃芪多糖的免疫調節作用機制及中藥黃芪的臨床抗癌效用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料：人單核細胞（THP-1）細胞，購自上海中科院細胞庫。黃芪多糖注射液（APS）由西安瑞盈生物科技有限公司生產（純度＞90%）。CCK-8（聯科公司）；佛波酯（PMA）、LPS（美國Sigma公司）；RT-PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒（日本TAKARA株式會社）；ELISA試劑盒（eBioscience公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）。超凈工作臺（Heal Force公司）；熒光化學顯微鏡（日本Nikon公司）；CO2恒溫孵育箱、Thermo 3111、溫度梯度PCR儀、Biometra T-Gradient、ABI 7500 Real-Time PCR儀等（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 造模方法：將THP-1細胞接種于六孔板，密度為（1～2）×106/ml，每孔細胞中加入濃度為100mg/L的PMA，刺激48h后細胞形態學上轉變為橢圓形、梭形或伸出偽足，由懸浮狀態轉變為貼壁狀態，表明THP-1細胞已成功轉化為巨噬細胞，在巨噬細胞內加入LPS（100ng/ml），共培養刺激6h建立炎癥模型。

1.2.2 分組及標本選取：對藥物濃度進行篩選，將THP-1源巨噬細胞（1.0×105個細胞/孔）接種于24孔細胞培養板，設置APS各濃度梯度組（0mg/ml、0.02mg/ml、0.2mg/ml、2、20mg/ml、40mg/ml），每孔中各加入含不同濃度APS的新鮮培養基作用24h，分別收集各組細胞，提取RNA，進行RT-PCR，篩選合適的APS濃度。實驗分組：將造模細胞接種于24孔培養板，每孔1.0×105個細胞，分別設置為THP-1空白對照組、THP-1+LPS模型組、THP-1+LPS+APS低濃度組、THP-1+LPS+APS高濃度組，各組分別加入2mg/ml、20mg/mlAPS作用24h、48h，結束以后各自加入LPS（100ng/ml）刺激6h，并將提取的各組細胞置于EP管中，在7.500g、4℃下離心5min，并將各組細胞培養上清液和THP-1源巨噬細胞收集起來。

1.2.3 RNA的提取、RT-PCR：提取各組細胞于EP管中，用TRIzol試劑裂解細胞，用DNA/RNA計算器系列分光光度計進行RNA濃度測定。用逆轉錄試劑盒配制15μl反應體系，采用溫度梯度PCR儀逆轉錄反應獲得cDNA。利用Primer Premier5.0軟件設計人TNF-α和IL-12、IL-10引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。應用ABI7500 Real-Time PCR儀進行檢測。RT-PCR反應參照SYBR?Premix Ex Taq TM說明書進行。使用ABI相對定量軟件進行擴增結果分析，基因相對表達量(處理組/未處理組)=2-ddCt，其中ddCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內參基因)未處理組。引物序列：TNF-α 5’GAC ACC ATG AGC CA GAA AG 3’5’GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC 3’IL-12 5’GAG AGT CAG AGG GGA CAA CAA 3’5’GTG AAC GGC ATC CAC CAT 3’IL-10 5’CCT GCC TAA CAT GCT TCGA 3’5’ATG TCT GGG TCT TGG TTC TCA 3’

1.3 觀察指標：分述如下。

1.3.1 細胞形態學改變及細胞活力：通過光鏡觀察，確認THP-1細胞分化為巨噬細胞。在96孔板中每孔（5000個細胞/孔）加入細胞懸液100μl，細胞培養箱中預孵育細胞24h，加入不同濃度的APS各10μl；繼續孵育一段時間后，再每孔加入CCK-810μl；繼續將細胞板放入培養箱中孵育1～4h；在酶標儀上讀取OD450值、參考波長OD650值。存活率（%）=（ODTHP-1-ODAPS）/ODTHP-1×100%。

1.3.2 細胞因子mRNA表達水平：分別提取各組細胞總RNA后，用RT-PCR技術檢測IL-10、IL-12和TNF-αmRNA基因表達量。進行產物熒光分析和融解曲線分析，基因相對表達量(處理組/未處理組)=2-ddCt，其中ddCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內參基因)未處理組。

1.3.3 細胞上清液中細胞因子含量：收集各組細胞培養上清，分別用人TNF-α及IL-12、IL-10ELISA試劑盒檢測細胞因子表達水平并繪制出各細胞因子的標準曲線，計算各組細胞培養液中的細胞因子含量。

2 結果

2.1 炎癥模型：在熒光倒置顯微鏡下（放大40倍）可見THP-1細胞在形態學上轉變為橢圓形、梭形或伸出偽足，并由懸浮狀態轉為貼壁狀態，表明THP-1細胞已轉化為巨噬細胞。

2.2 不同APS濃度對THP-1源巨噬細胞活性的影響：用CCK-8法檢測細胞活性，觀察不同濃度APS（0～40mg/ml）分別作用THP-1源巨噬細胞24h、48h后的細胞增殖情況。結果顯示，當黃芪多糖濃度為2mg/ml和20mg/ml時，細胞存活率較高；當黃芪多糖作用時間為48h時，細胞生存率低于50%，不利于細胞生長及后續實驗進行。經濃度篩選后，APS濃度為2mg/ml、20mg/ml時，THP-1巨噬細胞生存率較高且細胞因子的相對表達量較高且穩定。

2.3 利用RT-PCR檢測IL-10、IL-12、TNF-α mRNA表達量并篩選出合適的藥物濃度：將空白THP-1源巨噬細胞分泌的各細胞因子mRNA表達量作為表達標準量，IL-10、IL-12、TNF-α mRNA的標準表達量水平不盡相同。不論APS的高、低濃度，IL-12mRNA表達量均高于于空白對照組；且當APS濃度在2mg/ml時，IL-12mRNA表達量顯著高于空白對照組。而IL-10及TNF-α mRNA表達量不呈濃度依賴性，兩者皆在APS濃度為在2mg/ml及在20mg/ml時表達量較高。通過實驗數據及繪圖結果可知，APS濃度為2mg/ml、20mg/ml時對THP-1源巨噬細胞增殖活力影響相對較小，故以2mg/ml、20mg/ml濃度的APS進一步研究APS對各細胞因子轉錄水平及蛋白表達的影響。

2.4 2mg/ml及20mg/ml濃度APS對各細胞因子轉錄水平的影響：見表1。

表1 APS對LPS誘導的THP-1源巨噬細胞產生IL-10、IL-12、TNF-α的表達量影響（±s，pg/ml）

表1 APS對LPS誘導的THP-1源巨噬細胞產生IL-10、IL-12、TNF-α的表達量影響（±s，pg/ml）

注：同時間段，與THP-1空白對照組比較，*P＜0.05；與THP-1+LPS模型組比較，●P＜0.05；與同組24h比較，#P＜0.05。

組別THP-1空白對照組 (24h)THP-1+LPS模型組 (24h)THP-1+LPS+APS低濃度組（24h)THP-1+LPS+APS高濃度組（24h)THP-1空白對照組(48h)THP-1+LPS模型組(48h)THP-1+LPS+APS低濃度組（48h)THP-1+LPS+APS高濃度組（48h)TNF-αmRNA表達量1.0000±0.00000 1.1400±0.01732*1.9033±0.01528*●1.6833±0.01528*●1.2067±0.10066 2.2833±0.01528*2.3700±0.03000*#2.3133±0.04163*#n 3 3 3 3 3 3 3 3 IL-10mRNA表達量1.0000±0.00000 18.0367±0.16803*10.0367±0.17786*●5.0333±0.17243*●1.3933±0.03055 18.8000±0.20000*3.7667±0.25166*●#2.6333±0.35119*●#IL-12mRNA表達量1.0000±0.00000 4.4000±0.36056*9.4000±0.36056*●7.2333±0.25166*●1.6733±0.02517 10.9000±0.36056*13.9000±0.36056*●#12.8833±0.35473*●#

2.5 2mg/ml及20mg/ml濃度APS對IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表達水平的影響：見表2。

表2 APS對LPS誘導的THP-1源巨噬細胞產生IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表達量影響（±s，pg/ml）

表2 APS對LPS誘導的THP-1源巨噬細胞產生IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表達量影響（±s，pg/ml）

注：同時間段，與THP-1空白對照組比較，*P＜0.05；與THP-1+LPS模型組比較，●P＜0.05；與同組的24h比較，◆P＜0.05。

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3 討論

黃芪，具有益衛固表、升陽舉陷，托毒生肌等功效，是臨床常用扶正抗癌中藥[1]。黃芪多糖（APS）作為黃芪的主要抗癌成分，已被證實可作為免疫調節劑，在抗腫瘤方面發揮積極作用[3-4]。細胞因子在腫瘤免疫中發揮重要作用，主要參與吞噬病原體、殺傷腫瘤細胞，并可通過誘導抗腫瘤免疫長期維持或消除已形成的腫瘤來實現免疫調控[5]。IL-12通過誘導輔助T細胞分化，促進輔助Th1細胞增殖來參與細胞免疫，發現其能夠抑制腫瘤血管生成，在抗腫瘤免疫中發揮正向調節作用。TNF-α是能抑制成骨細胞和刺激破骨細胞的多功能細胞因子，能直接殺傷和抑制腫瘤細胞[6]，在分子水平發揮作用[7]。IL-10作為免疫抑制因子，通過抑制多種效應分子來抑制機體的抗腫瘤免疫，通過誘導產生IL-2，IFN-C，抑制IL-12及TNF-α的表達，從而抑制了細胞免疫應答[8]。目前許多學者致力于研究中藥制劑中的有效成分是否能夠提高巨噬細胞活性，進一步實現抗腫瘤免疫，但關于黃芪主要抗癌成分——黃芪多糖（APS）對人單核細胞株THP-1源巨噬細胞的免疫調節作用的研究尚無文獻報道。基于此，本實驗將APS作用于THP-1源巨噬細胞，運用RT-PCR及ELISA法觀察其對經LPS誘導的THP-1源巨噬細胞的表達TNF-α和IL-12、IL-10的影響，以明確黃芪多糖對巨噬細胞免疫功能的確切影響。

本次實驗結果表明，一方面黃芪多糖能有效激活THP-1源巨噬細胞，下調其IL-10的基因表達量；并發現不同濃度APS對IL-10mRNA表達的下調作用呈一定的濃度-效應關系（P＜0.05）。此外，ELISA法檢測細胞上清液中細胞含量也進一步驗證了APS能夠降低由LPS刺激引起的IL-10表達的增加，這有可能是APS發揮抗腫瘤作用的機制之一。另一方面黃芪多糖能有效激活THP-1源巨噬細胞，上調其IL-12、TNF-α的基因表達量，且兩者的表達量與APS的濃度與時間呈一定的依賴關系。這與APS對IL-10的調節作用相反，也體現了炎癥細胞因子在抗炎及促炎兩者之間的相互制約關系。

綜上，筆者通過本實驗發現，黃芪多糖(APS)可能通過影響相關因子表達來調控機體免疫調節從而實現抗腫瘤作用，且呈一定的濃度與時間依賴性，這為中藥黃芪及其有效抗腫瘤成分黃芪多糖在腫瘤免疫治療方面提供一定參考依據，但其具體作用機制仍有待進一步的探索及驗證。