脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和黃曲霉毒素B1單一及聯合染毒對小鼠腦組織病理變化、抗氧化性能和緊密連接蛋白表達量的影響

王希春，曹 利，劉 秦，董妍麗，王中正，2，劉錦芳，朱 雷，馮士彬，李 玉，吳金節

(1.安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036； 2.安徽省銅陵市農業委員會，安徽 銅陵 244000)

霉菌毒素(mycotoxin)是由霉菌在特定環境下產生的一類次生代謝產物，在飼料與食品等植物源性產品中普遍存在[1]。霉菌毒素侵入機體后，會抑制酶類、蛋白質等合成，破壞細胞結構，對人類和動物的健康造成嚴重危害[2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol， DON)和黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1， AFB1)是飼料和農作物中污染水平和污染率最高的2種霉菌毒素。研究表明，DON可以通過血腦屏障到達大腦，刺激大腦的不同區域，導致大腦組織異常[3]，產生嘔吐、腹瀉、厭食、生長障礙和免疫功能失調等不良影響[4]。AFB1在黃曲霉毒素中毒性最強[5]，具有很強的致癌性，能抑制動物的免疫功能[6]，降低動物的生產性能，引起動物二次感染，嚴重的甚至致其死亡，并能殘留在動物產品中，威脅人類健康[7]。此外，AFB1具有一定的神經毒性作用，當毒素進入神經組織和腦膜時，會引起一系列臨床癥狀，如興奮或抑制、喪失感覺和反應遲鈍等，可能對人畜造成系統性損害[8]。有研究表明，霉菌毒素會破壞緊密連接蛋白完整性，使屏障功能受損[9]。

目前，有關DON和AFB1兩者毒性和染毒水平的研究較多，但大多局限于單一毒素，且對神經毒性研究較少。本研究以昆明系雄性小鼠為研究對象，根據小鼠腦組織病理變化、抗氧化性能及緊密連接蛋白表達量變化，研究DON和AFB1單一及聯合染毒對小鼠的神經毒性作用，為后續深入研究DON和AFB1的聯合毒性及作用機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

體質量(14±1)g的18日齡昆明系雄性小鼠96只，購于愛爾麥特科技有限公司。脫氧血腐鐮刀菌烯醇(DON)和黃曲霉毒素B1(AFB1)標準品，購于美國Sigma公司；CAT、GSH-Px、NO、T-AOC、MDA和SOD檢測試劑盒，購于上海源葉生物科技有限公。GTR16-2型高速臺式冷凍離心機，購于北京新時代北利醫療器械有限公司；Arktik多功能PCR儀和Multiskan Mk3型酶標儀，購于美國Thermo公司；Bio-Rad-1658001垂直電泳儀，購于南京貝登醫療股份有限公司；JEM-1230透射電子顯微鏡，購于日本電子株式會社。

1.2 試驗設計

選取96只18日齡昆明系雄性小鼠，隨機分為對照組、DON組、AFB1組和AD組(DON+AFB1組)，每組分別灌服生理鹽水(1mL)、500 μg·kg-1DON、200 μg·kg-1AFB1和200 μg·kg-1AFB1+500 μg·kg-1DON，連續灌服45 d。

1.3 飼養管理

試驗期間小鼠自由采食和飲水，每3 d更換1次墊料，鼠舍溫度在20～25 ℃之間，保持環境清潔。小鼠預飼1周后，每天上午9:00—11:00對小鼠進行灌胃。

1.4 樣本采集

分別于試驗第0、15、30、45天時，每組隨機選擇6只小鼠，麻醉后頸椎脫臼處死。解剖觀察病變，并迅速取出腦組織。將部分腦組織放入凍存管，保存于液氮中；另一部分加入組織溶解液快速勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液儲存于-80 ℃冰箱中。

1.5 指標測定

1.5.1 形態學觀察

制作石蠟切片并進行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5.2 抗氧化指標檢測

按照試劑盒說明書檢測T-AOC、MDA、NO、SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化指標。

1.5.3 緊密連接蛋白ZO-1和OccludinmRNA表達量的檢測

以Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測D值，計算RNA含量和純度。用StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix試劑盒進行反轉錄。根據Genebank中公布的引物序列，使用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計引物序列(表1)。應用StepOneTMReal-Time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix試劑盒進行反應。

反應體系為：DNA模板4 μL，上、下游引物各2 μL，Bestar?SybrGreen qPCR master mix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。

反應程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；55 ℃ 1 min后，按0.05 ℃·s-1升溫至98 ℃，20 ℃ 10 s。

1.6 數據統計

試驗數據采用Excel 2007進行初步處理，SPSS 17.0軟件中的方差分析方法進行單因素方差分析，以P<0.05作為判斷差異顯著性的標準。試驗數據表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 DON與AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦組織形態學的影響

如圖1所示，對照組腦細胞結構良好，形態規則，無明顯病變。隨著時間的增加，DON組胞漿疏松，間隙增大，細胞呈空泡狀；AFB1組細胞腫脹變形，細胞稀疏；AD組細胞核變形固縮，有少量出血點，空泡化細胞數量增多，部分神經纖維斷裂。

2.2 DON與AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦組織抗氧化能力的影響

由表2可知，第15天時，AD組腦組織中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)，NO、MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，AFB1組T-AOC、CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)。

第30天時，AD組腦組織中T-AOC、GSH-Px、CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)，MDA、NO含量顯著高于對照組(P<0.05)，DON組T-AOC、CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)，DON組和AFB1組腦組織中GSH-Px顯著低于對照組(P<0.05)，MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)。

第45天時，AD組腦組織中T-AOC、SOD活性極顯著低于對照組(P<0.05)，MDA、NO活性顯著高于對照組(P<0.05)，AFB1組腦組織中MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，DON組和AFB1組腦組織中NO含量顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 DON與AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦組織ZO-1和Occludin mRNA表達量的影響

由表3可知，第15天時，各染毒組腦組織ZO-1 mRNA表達量與對照組相比均顯著降低(P<0.05)；AD組腦組織ZO-1 mRNA表達量顯著低于AFB1組(P<0.05)；DON組與AD組腦組織OccludinmRNA表達量顯著低于對照組和AFB1組(P<0.05)，AFB1組腦組織OccludinmRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05)。第30天時，DON組和AD組腦組織ZO-1 mRNA表達量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，AFB1組腦組織ZO-1 mRNA表達量與對照組相比顯著升高(P<0.05)；DON組腦組織OccludinmRNA表達量與對照組相比顯著升高(P<0.05)，AFB1組和AD組腦組織OccludinmRNA表達量與對照組和DON組相比顯著降低(P<0.05)。

表1 基因引物參數

Table1Primer parameters of genes

基因Gene登錄號Accession number引物Primer序列Sequences (5′→3′)產物Product/bp18SNR_00327818S-FCGGCGACGACCCATTCGAAC9918S-RGAATCGAACCCTGATTCCCCGTCZO-1NM_001163574ZO-1-FTGAACGCTCTCATAAGCTTCGTAA88ZO-1-RACCGTACCAACCATCATTCATTGOccludinNM_008756Occludin-FTGTGGGATAAGGAACACATTTATGA69Occludin-RCAGACACATTTTTAACCCACTCTTCA

A1～D1，A2～D2，A3～D3分別表示第15、30、45天的腦組織切片。A，對照組；B，DON組；C，AFB1組；D，AD組。A1-D1，A2-D2，A3-D3 represented the slice chart of brain tissues on day 15， 30 and 45. A， control group; B， DON group; C， AFB1 group; D， AD group.圖1 腦組織切片(400×)Fig.1 Slice chart of brain tissues (400×)

表2 不同處理對腦組織氧化與抗氧化指標的影響

Table2Effects of different treatments on oxidant and antioxidant indexes of brain

指標Indext/d對照組Control groupDON組DON groupAFB1組AFB1 groupAD組AD groupT-AOC/(U·mL-1)060.11±2.07 a61.78±3.45 a60.29±2.06 a61.22±2.41 a1562.90±2.96 a60.45±0.41 ab59.69±0.45 bc56.78±2.19 c3058.40±2.01 a56.04±3.98 b56.60±1.79 ab53.03±2.54 c4560.01±1.69 a56.59±2.47 ab56.61±2.98 ab53.13±1.66 bMDA/(nmol·L-1)049.20±1.69 a47.19±1.90 a47.90±2.59 a48.09±1.28 a1552.39±1.39 b54.44±2.40 ab53.89±2.18 ab56.51±0.70 a3048.03±2.01 b52.01±2.98 a51.30±1.40 a53.61±0.33 a4552.61±1.19 c54.97±3.33 c56.99±4.21 b61.57±1.56 aSOD/(U·mL-1)0749.69±17.69 a749.61±18.42 a753.62±29.58 a747.51±21.88 a15799.31±23.36 a730.54±44.46 ab735.72±47.67 ab700.55±89.76 b30830.57±16.28 a780.29±79.63 a796.53±82.58 a739.24±50.66 a45965.73±29.87 a909.98±41.46 ab914.25±8.73 ab862.67±63.62 bGSH-Px/(U·mL-1)0960.76±62.86 a951.63±38.52 a960.26±24.32 a964.74±36.73 a15989.75±12.46 a935.64±35.83 ab953,72±17.45 ab875.61±69.00 b30991.87±39.12 a883.45±99.78 b886.87±33.29 b884.66±17.42 b451008.39±49.73 a988.72±34.98 a983.28±95.72 a966.78±98.26 aCAT/(U·mL-1)0193.79±8.88 a194.95±5.01 a193.67±3.71 a194.24±6.89 a15196.25±8.79 a185.78±2.01 ab183.72±3.73 bc173.24±4.85 c30190.79±6.33 a170.27±8.61 b178.47±5.44 a169.88±4.89 c45197.21±13.42 a196.42±6.73 a187.00±16.21 a183.43±15.71 aNO/(U·mL-1)074.32±2.03 a74.09±1.51 a74.01±3.09 a73.50±2.78 a1574.58±6.30 a78.37±4.59 a76.67±2.41 a80.01±1.21 a3074.68±2.07 b77.02±1.90 b77.29±2.83 b82.15±1.29 a4576.09±1.39 b85.10±5.81 a87.39±2.78 a88.68±2.81 a

同行數據后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

In the same row， values marked without the same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

表3 不同處理對腦組織ZO-1和OccludinmRNA表達量的比較

Table3Comparisons of brainZO-1 andOccludinmRNA expression levels in different treatment group

指標Indext/d對照組Control groupDON組DON groupAFB1組AFB1 groupAD組AD groupZO-1 mRNA相對表達量151.00 a0.72 c0.79 b0.62 cRelative expression of ZO-1 mRNA301.00 b0.80 d1.10 a0.88 c451.00 b1.03 b1.28 a1.30 aOccludin mRNA相對表達量151.00 b0.72 c1.39 a0.44 dRelative expression of Occludin mRNA301.00 b1.26 a0.48 d0.51 c451.00 a0.31 d0.44 b0.36 c

第45天時，AFB1組和AD組腦組織ZO-1 mRNA表達量與對照組和DON組相比顯著升高(P<0.05)；各染毒組腦組織OccludinmRNA表達量與對照組相比均顯著降低(P<0.05)，AD組腦組織OccludinmRNA表達量與AFB1組相比顯著降低(P<0.05)。

3 討論

3.1 DON與AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦組織形態結構的影響

研究表明，霉菌毒素會影響大腦的發育[10]和神經細胞的生長[11]，耿芳芳等[12]研究顯示，脫氧血腐鐮刀菌烯醇可引起雛雞腦組織形態結構改變，并且損傷神經元細胞。本試驗觀察到染毒組小鼠腦組織出現不同程度的水腫、空泡、核變性固縮及部分神經纖維斷裂的現象，且AD組的變化較為明顯，說明DON和AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦損傷程度不同。

3.2 DON與AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦組織抗氧化能力的影響

DON與AFB1對氧化和抗氧化能力的影響一直備受關注，T-AOC主要基于活性氧物質的動態平衡，反映了腦組織抗氧化能力的綜合指標[13]。Dinu等[14]提出，由于細胞的抗氧化系統被霉菌毒素損害，因此加速了自由基的產生，最終增加細胞的過氧化反應。MDA是脂質過氧化的最終產物，能夠通過影響蛋白質的結構從而引起細胞損傷。NO由左旋精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下在生物組織中合成的，它通過NOS的酶家族作為有氧運動中重要的生物信號，影響神經活動和線粒體生物合成[15]。Ren等[16]通過對小鼠進行玉米赤霉烯酮(ZEA)和DON聯合染毒后，發現在3 d和5 d后，染毒組MDA和NO含量升高。SOD是一種主要的防御物質，是最有效的抗氧化劑和自由基清除劑，可以降低氧化應激和炎癥介質的活化，其主要作用是將超氧自由基轉化為氧和水，以減少自由基的損傷和降解[17]。GSH-Px和CAT也是生物體內重要的抗氧化防御酶[18]，對于大腦氧化代謝產物的清除和保護發育期的腦起重要作用[19]。當生物體接觸到污染物時，這些污染物在體內參與氧化還原循環，產生大量活性氧、過氧化氫等，導致DNA斷裂、脂質過氧化、酶失活等一系列氧化損傷[20]。李洋[21]研究發現，ZEA、DON單一及其聯合染毒使小腦組織SOD、GSH-Px、CAT活性明顯下降。以上報道與本試驗結果一致，DON與AFB1單一及聯合染毒均可降低小鼠的抗氧化能力。

3.3 DON與AFB1單一及聯合染毒對小鼠腦組織中緊密連接蛋白表達量的影響

血腦屏障是一個動態調節界面，存在于腦和脊髓中的毛細血管與神經組織之間，是保持中樞神經系統內環境平衡和穩定的重要結構[22]。緊密連接是位于腦微血管內皮細胞頂端的蛋白分子復合體，是調節血腦屏障通透性的重要結構和功能基礎[23]。已有研究表明，ZO-1和Occludin是腦血管內皮細胞中緊密相連的2種主要細胞粘附分子，對維持血腦屏障的完整性是必不可少的。在細胞質中，Occludin的氨基端和羧基端與ZO-1緊密結合，使緊密連接固定在細胞膜上[24]。據報道，動物緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA的表達下降會破壞其血腦屏障的完整性。ZO-1能封閉相鄰內皮細胞間的細胞間隙，并形成選擇性滲透屏障，增加腦血管通透性，最終導致腦水腫的形成。袁有才等[25]試驗表明，保護緊密蛋白Occludin、Claudins-5的表達可能會減少血腦屏障損害，保護血腦屏障的完整性。本試驗結果表明，在第15和30天，DON和AFB1能顯著降低小鼠腦組織中ZO-1和OccludinmRNA的表達，這可能是由于DON和AFB1破壞了血腦屏障的完整性所致。

綜上所述，DON與AFB1可造成小鼠腦組織不同程度的病理變化，增強氧化能力，產生氧化損傷，腦組織緊密連接蛋白ZO-1和OccludinmRNA的表達量降低，血腦屏障的完整性被破壞，且DON與AFB1聯合毒性大于單一毒性，兩者具有協同效應。