土壤酸化對(duì)景天三七葉片光合特性及超微結(jié)構(gòu)的影響

王一鳴，龍勝舉，陳 延，賀忠群，*，趙英鵬，仰路希，嚴(yán)文一

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000)

土壤酸化在自然界中普遍存在[1]，例如：大氣環(huán)境污染導(dǎo)致的酸沉降增加[2]、農(nóng)業(yè)上銨態(tài)氮肥等化學(xué)肥料的不當(dāng)施用[3]、農(nóng)作物收獲后導(dǎo)致土壤中鈣、鎂、鉀等鹽基養(yǎng)分的減少等[4]。土壤酸化不僅會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)[5]，導(dǎo)致礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的流失和重金屬的活化[6]，還會(huì)抑制土壤微生物活性[7]，從而影響作物對(duì)于土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用。同時(shí)土壤酸化還會(huì)釋放出大量的活性鋁離子[8]，對(duì)根系的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[9]，破壞細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性[10]，破壞葉綠體被膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致葉綠素含量降低，使光合作用在一定程度上受到抑制[11]，從而降低作物的產(chǎn)量及品質(zhì)。中國(guó)酸化土壤總面積高達(dá)2.04×108hm2，約占全國(guó)土壤面積的22.7%，超過40%的耕地出現(xiàn)不同程度的酸化[12]，因此土壤酸化已經(jīng)成為了嚴(yán)重制約中國(guó)糧食安全、農(nóng)田和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的因素之一。

景天三七(SedumaizoonL.)又名費(fèi)菜，景天科景天屬多年生草本植物，是一種從傳統(tǒng)繁育中篩選出來的野生蔬菜，富含三萜、甾醇、黃酮類等活性物質(zhì)[13]，具有保護(hù)心腦血管、促進(jìn)血液循環(huán)、增強(qiáng)免疫力等保健功效[14]，目前已經(jīng)成為具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的綠色保健野生蔬菜[15]。景天三七在生產(chǎn)栽培中表現(xiàn)出了極強(qiáng)的抗逆性，但在生理逆境方面的研究較少。隨著景天三七栽培面積的越來越廣泛以及中國(guó)可耕地土壤酸化面積的逐步增加，研究土壤酸化對(duì)景天三七葉片光合及超微結(jié)構(gòu)的影響，可為景天三七在酸化土壤中的生產(chǎn)栽培提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土壤來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，pH 6.6，速效氮53.6 mg·kg-1，速效磷44.1 mg·kg-1，速效鉀176.7 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)10.2 mg·kg-1。

植物為景天三七(SedumaizoonL.)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。所有景天三七材料于5月中旬插繁殖20 d后得到。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將土壤風(fēng)干過2 mm孔徑篩，取出部分土壤用稀釋后的濃硫酸預(yù)調(diào)酸，保濕并靜置7 d后，再次風(fēng)干土壤測(cè)定pH，繪制土壤pH變化曲線，并計(jì)算出土壤調(diào)酸公式。根據(jù)得到的調(diào)酸公式對(duì)土壤進(jìn)行調(diào)酸，得到土壤pH 3.4(重度)、pH 4.6(中度)、pH 5.5(輕度)、pH 6.6(CK)4個(gè)梯度的土壤，然后將株高4 cm的景天三七移栽到裝好不同土壤pH的營(yíng)養(yǎng)缽(12 cm×13 cm)中培養(yǎng)，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽移栽1株并加入300 g該處理土壤，每個(gè)處理8盆每盆1株，重復(fù)3次，共96盆96株景天三七。將植株置于通風(fēng)良好的塑料大棚中進(jìn)行常規(guī)栽培，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽下放置托盤，在澆水的過程中做到少量多次，用土壤三參數(shù)儀測(cè)定土壤含水量，使其保持在75%左右，以使土壤pH保持穩(wěn)定，在28 d時(shí)測(cè)定相關(guān)的指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 土壤pH及鋁離子含量的測(cè)定

土壤pH的測(cè)定參考魯如坤[16]的方法；土壤中鋁離子含量測(cè)定使用百靈達(dá)便攜式土壤養(yǎng)分測(cè)定儀SKW500測(cè)定。

1.3.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

葉片相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參考王學(xué)奎[17]的方法；葉片可溶性糖含量的測(cè)定參考熊慶娥[18]的方法；葉片可溶性蛋白的測(cè)定參考熊慶娥[18]的考馬斯亮蘭G-250染色法；葉片丙二醛(MDA)含量的測(cè)定參考熊慶娥[18]的硫代巴比妥酸法；葉片游離脯氨酸含量的測(cè)定參考熊慶娥[18]的茚三酮比色法；葉綠素含量的測(cè)定采用直接浸提法[19]。

SOD活性的測(cè)定參考李合生[20]的方法；CAT活性的測(cè)定參考李忠光等[21]的方法；APX活性的測(cè)定參考Nakano等[22]的方法；GR活性的測(cè)定參照Ma等[23]的方法。

1.3.3 光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

脅迫28 d時(shí)，在早上10:00采用透明葉室測(cè)定自然光照下的光合參數(shù)(光照強(qiáng)度為21 383 lx)，測(cè)定選取景天三七中上部生長(zhǎng)健壯的成熟葉片，利用英國(guó)PPS公司生產(chǎn)的CIRAS-2型光合測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定[24]。

用暗適應(yīng)葉夾葉片30 min后，用PAM-2500熒光儀(Walz，Effeltrich，Germany)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，Meas. Ligth int.設(shè)置為4檔，Act. Ligtht int.設(shè)置為9檔，Sat. Pulse int.設(shè)置為10檔，Slow Induction中Delay設(shè)置為40 s，Clock設(shè)置為20 s，Width設(shè)置為210 s，測(cè)定方法參照Cuddy等[25]。

1.3.4 葉片超顯微結(jié)構(gòu)的觀察

景天三七生長(zhǎng)28 d后，取上部葉片和根尖，送四川大學(xué)電鏡室，采用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)有顯著差異(P<0.05)的處理采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酸化對(duì)土壤中鋁離子含量、葉片細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響

由表1可知，土壤中鋁離子含量、葉片細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量隨著土壤酸化程度加深而迅速升高，在pH 4.6和pH 3.4的土壤中鋁離子含量分別是CK的43倍和120倍，但在pH 5.5輕度酸化情況下則與CK無顯著差異。

2.2 土壤酸化對(duì)景天三七葉光合特性的影響

總?cè)~綠素含量隨著土壤酸化程度的加深而逐漸降低，但對(duì)輕度和中度酸化下的光合參數(shù)沒有顯著影響；而在重度酸化下，光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度則比CK顯著降低了70.6%、67.1%、77.4%、80.5%，氣孔限制值顯著升高64.7%(表2)。

植株的熒光參數(shù)在輕度和中度酸化下與CK相比沒有顯著差異，但在重度酸化下，初始熒光Fo、最大熒光Fm、光化學(xué)效率ΦPSⅡ、光化學(xué)淬滅qP、光系統(tǒng)Ⅱ最大光合效率Fv/Fm迅速降低，非光化學(xué)淬滅NPQ則顯著升高(表3)。

表1 土壤酸化對(duì)景天三七葉片相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛和土壤中鋁離子含量的影響

Table1Effect of soil acidification on relative conductivity and the content of MDA ofSedumaizoonL. leaves and aluminum ions in soil

處理Treatment鋁離子含量Aluminum ions content/(mg·kg-1)相對(duì)電導(dǎo)率Relative conductivity/%丙二醛MDA content/(μmol·g-1)pH 3.464.01±3.17 a32.67±1.53 a0.24±0.05 apH 4.622.92±2.16 b28.33±1.89 b0.17±0.01 bpH 5.50.78±0.06 c25.00±1.73 c0.13±0.01 cpH 6.60.53±0.03 c24.33±2.52 c0.14±0.01 c

同列不同行處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values in the same column without the same lowercase letters showed the significant difference(P<0.05). The same as below.

表2 土壤酸化對(duì)景天三七葉葉綠素含量及光合參數(shù)的影響

Table2Effect of soil acidification on chlorophyll content and photosynthetic parameters inSedumaizoonL.

處理Treatment凈光合速率Pn/(μmol·m-2·s-1)胞間CO2濃度Ci/(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2·s-1)氣孔導(dǎo)度Gs/(mol·m-2·s-1)氣孔限制值Ls總?cè)~綠素含量Total chlorophyllcontent/(mg·g-1)pH 3.42.82±0.76 b65.57±24.72 b0.45±0.19 b0.015±0.001 b0.84±0.11 a1.30±0.06 cpH 4.68.51±0.63 a173.83±12.64 a2.08±0.09 a0.081±0.001 a0.58±0.05 b1.61±0.09 bpH 5.59.09±1.25 a187.20±24.57 a2.11±0.31 a0.077±0.011 a0.52±0.06 b1.81±0.08 bpH 6.69.58±0.80 a199.08±25.91 a1.99±0.19 a0.077±0.001 a0.51±0.04 b2.28±0.13 a

表3 土壤酸化對(duì)景天三七葉片熒光參數(shù)的影響

Table3Effect of soil acidification on leaf fluorescence parameters inSedumaizoonL.

處理Treatment初始熒光Fo最大熒光Fm光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率ΦPSⅡ光化學(xué)淬滅qP非光化學(xué)淬滅NPQ光系統(tǒng)Ⅱ最大光合效率Fv/FmpH 3.40.424±0.011 b1.64±0.08 b0.236±0.015 b0.429±0.099 b1.12±0.25 a0.741±0.012 bpH 4.60.497±0.030 a2.25±0.14 a0.505±0.036 a0.724±0.027 a0.51±0.15 b0.779±0.013 apH 5.50.500±0.019 a2.35±0.06 a0.513±0.039 a0.740±0.052 a0.70±0.08 b0.787±0.008 apH 6.60.488±0.016 a2.32±0.15 a0.472±0.016 a0.698±0.075 a0.61±0.11 b0.789±0.021 a

2.3 土壤酸化對(duì)景天三七葉片超顯微結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可以看出，在CK、輕度和中度酸化下，葉綠體沿細(xì)胞膜均勻分布，呈橢圓形，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，基粒片層結(jié)構(gòu)規(guī)則有序，平行排列，沒有出現(xiàn)明顯變形或片層之間出現(xiàn)明顯間隙，嗜鋨顆粒體積都相對(duì)較小，但數(shù)量相對(duì)較多；而在重度酸化下，葉綠體寬度增加并脫離細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)中扎堆分布，發(fā)生不同程度的腫脹變形，外背膜出現(xiàn)模糊的現(xiàn)象，基粒所占體積變小，片層間出現(xiàn)明顯間隙，類囊體間出現(xiàn)扭曲或者變形，部分類囊體膜糊不清，嗜鋨顆粒明顯增大，但數(shù)量相對(duì)減少。CK中葉綠體內(nèi)淀粉粒含量較少且體積較??；輕度和中度酸化下，淀粉粒則大小不一，但在葉綠體內(nèi)均有分布；重度酸化下，淀粉粒大量增加且體積較大，占據(jù)了葉綠體接近一半或四分之三容積。

a，葉綠體；b，淀粉粒；c，嗜鋨顆粒；d，基粒片層；e，線粒體；f，葉綠體緊貼細(xì)胞膜；g，細(xì)胞間隙。a， Chloroplast；b， Starch granule；c， Osmiophilic particles；d， Grana lamella；e， Mitochondria；f， Chloroplast was close to the cell membrane；g， Intercellular.圖1 土壤酸脅迫對(duì)景天三七葉片超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of soil acidification on ultrastructure of Sedum aizoon L. leaves

2.4 土壤酸化對(duì)植株葉片滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶活性的影響

在輕度酸化下，葉片內(nèi)可溶性糖含量比CK顯著升高26%，其他滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)與CK無顯著差異。隨著土壤酸化程度的加劇，可溶性蛋白、游離脯氨酸含量顯著增加，葉片可溶性糖含量則迅速降低(表4)。

SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶活性隨著土壤酸化程度加深而迅速升高，但在輕度酸化下，除CAT活性比CK顯著增高12.3%外，其他抗氧化酶活性與CK則無顯著差異(表5)。

表4 土壤酸化對(duì)景天三七葉片滲透調(diào)節(jié)的影響

Table4Effect of soil acidification on leaf osmotic regulation inSedumaizoonL.

處理Treatment可溶性糖Soluble sugar content/(μg·g-1)可溶性蛋白Soluble protein content/(mg·g-1)游離脯氨酸Free proline content/(μg·g-1)pH 3.472.09±7.44 c1.65±0.03 a147.58±11.25 apH 4.675.36±7.88 c1.32±0.36 b120.94±7.83 bpH 5.5155.61±10.70 a0.72±0.09 c102.01±1.23 cpH 6.6115.52±5.32 b0.73±0.16 c98.38±8.91 c

表5 土壤酸化對(duì)景天三七葉片抗氧化酶活性的影響

Table5Effect of soil acidification on leaf antioxidant enzyme activity inSedumaizoonL.

處理Treatment超氧化物歧化酶SOD/(U·g-1)過氧化物酶CAT/(U·g-1)抗壞血酸過氧化物酶APX/(U·g-1)谷胱甘肽還原酶GR/(U·g-1)pH 3.4512.40±14.41 a289.65±11.70 a71.57±8.43 a22.79±2.58 apH 4.6439.64±18.55 b272.08±7.98 a52.92±4.56 b15.23±3.42 bpH 5.5355.96±20.00 c210.01±14.77 b39.83±6.23 c9.43±1.49 cpH 6.6339.79±15.05 c187.08±6.47 c34.09±2.08 c9.16±2.06 c

3 討論

有研究表明，鋁離子作為潛性酸的主要交換來源，土壤中鋁離子含量的增加是土壤酸化的結(jié)果，不是其酸化的原因[28]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行土壤調(diào)酸后測(cè)定鋁離子含量發(fā)現(xiàn)在土壤pH低于4.6以后鋁離子溶出量急劇增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Rosenberg等[26]相似。丙二醛(MDA)和細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率的變化可以反映出細(xì)胞膜脂的過氧化程度以及質(zhì)膜透性變化所導(dǎo)致的電解質(zhì)外滲情況[27]，在中度和重度酸化下，植株丙二醛(MDA)含量和細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加，表明在一定鋁離子濃度的作用下植株細(xì)胞膜脂受到了不同程度的氧化作用，其中重度酸化強(qiáng)于中度酸化。

植物的滲透調(diào)節(jié)、抗氧化酶活性變化以及膜脂過氧化作用已廣泛用于對(duì)植物逆境反應(yīng)機(jī)制的研究?？扇苄蕴?、可溶性蛋白、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在逆境脅迫下調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透勢(shì)及維持細(xì)胞內(nèi)相關(guān)代謝功能的正常進(jìn)行發(fā)揮著重要的作用[28]。SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶在平衡細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基及清除上是植株體內(nèi)不可缺少的酶類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著土壤酸化程度加劇，除了可溶性糖含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)外，其他的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及抗氧化酶活性均不斷增加以保護(hù)或減輕細(xì)胞膜脂受到的過氧化作用，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透調(diào)節(jié)的平衡，特別是中度和重度酸化下的可溶性蛋白、游離脯氨酸和抗氧化酶活性顯著高于CK，表明在土壤pH低于4.6以后，土壤酸脅迫會(huì)導(dǎo)致景天三七葉片細(xì)胞的膜質(zhì)過氧化，并對(duì)細(xì)胞的正常生理代謝造成影響。

通過對(duì)葉綠素含量、光合及熒光參數(shù)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，雖然土壤酸化導(dǎo)致葉片內(nèi)葉綠素含量的降低，但在輕度和中度酸化條件下植株光合作用能正常進(jìn)行。只有當(dāng)土壤pH低于4.6達(dá)到重度酸化后，Pn、Gs、Ci、Tr、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、Fm才迅速降低，Ls、NPQ則顯著升高。這表明重度酸化導(dǎo)致光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心遭到破壞或可逆失活，光合電子傳遞活性受到抑制，植株光合能力遭到嚴(yán)重抑制，這與井大煒等[29]的結(jié)果相似。

而對(duì)葉片的超顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在CK、輕度和中度酸化下，葉綠體沿細(xì)胞膜均勻分布，結(jié)構(gòu)完整，基粒片層結(jié)構(gòu)規(guī)則有序，以利于最大程度接受光能進(jìn)行光合作用；而在重度酸化下，葉綠體不再沿著細(xì)胞膜均勻分布，并在細(xì)胞質(zhì)中扎堆聚集，并且葉綠體外背膜出現(xiàn)模糊，基粒片層間出現(xiàn)明顯間隙，部分類囊體變得膜糊不清，這可能是無法及時(shí)清除的活性氧自由基對(duì)葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴(yán)重破壞。綜上所述，為保證景天三七光合代謝的正常進(jìn)行以及葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的完整，植株栽培的土壤pH不應(yīng)低于4.6。