樹莓葉總黃酮的超聲波提取及純化前后抗氧化性研究

余妍 劉詠煌 張青峰

摘 要 目的：探討樹莓葉黃酮類物質純化前后的抗氧化性比較。方法：采用超聲波最佳提取條件提取黃酮后，粗提液中黃酮物質與經AB-8大孔樹脂純化后的提取液中黃酮物質對DPPH自由基的清除率進行比較。結果：超聲波提取后的紅樹莓粗提液中黃酮得率是5.227%，純化后的提取液中黃酮得率是11.419%。黑樹莓粗提液中黃酮得率為8.228%，純化后提取液黃酮得率提高到16.640%。樹莓葉黃酮純化前后抗氧化性存在較大差異，純化后抗氧化性增強。當提取液濃度均為0.02 mg·mL-1時，紅樹莓純化物對DPPH自由基的清除率增加23.36%，黑樹莓純化物對DPPH自由基清除率增加29.89%。結論：純化后的黃酮提取液隨著黃酮含量的增加抗氧化性增強。

關鍵詞 樹莓葉;總黃酮;抗氧化性;DPPH自由基

中圖分類號：TS255.1 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.068

樹莓屬于薔薇科植物，又名木莓、托盤、馬林等，是多年生小灌木。在果樹分類學上屬漿果類樹莓屬（Rubus）果樹。根據果實成熟時的顏色，栽培上將樹莓分成黑樹莓、紅樹莓、黃樹莓、藍樹莓等。樹莓的果實、莖、根皆可入藥，具有很高的藥用價值，被稱之為“生命之果”[1]。樹莓黃酮是樹莓代謝工程中產生的一種重要的有機物，能夠預防心腦血管疾病，而且可以抑制癌細胞和提高記憶力[2]。

樹莓葉中最常用的黃酮提取方法是有機溶劑提取[3]，近年來超聲波提取技術越來越成熟，超聲波法原理主要是利用超聲波產生的強烈震動、高加速度、強烈空化效應及攪拌作用等，加速植物有效成分進入溶劑，從而有效提高黃酮化合物的獲得率，縮短提取時間，并且可免去高溫對活性成分的影響[4]。自由基性質活潑，有很強的氧化能力，對人體易造成很大的傷害，與人體的許多疾病有著密切的聯系，黃酮類化合物具有很好的清除自由基能力。本研究以黑樹莓葉與紅樹莓葉為原料，采用超聲提取法最佳提取工藝，提取黃酮類化合物，以AB-8大孔樹脂作為吸附劑進行純化。通過純化前后DPPH自由基的清除率反映其抗氧化能力的大小，為今后黃酮類物質在實踐中的應用提供基礎性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

紅樹莓葉和黑樹莓葉購自南京金瑞藍莓專業合作社，洗凈瀝干后，50 ℃條件下烘干，粉碎成粗粉備用。蘆丁標準品（上海源葉生物有限公司）;石油醚（天津市大茂化學試劑廠）;DPPH自由基（上海源葉生物有限公司）;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鎂粉、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。另外，還有MODEL722可見分光光度計（上海現科分光儀器有限公司）、電熱恒溫干燥箱和R20GB旋轉蒸發儀（上海下豐實業有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樹莓葉前處理

將已粉碎的樹莓葉5.0 g用石油醚按料液比1∶20的比例用超聲波20 min進行脫脂，然后抽濾，將抽濾后的樹莓葉放在桌面上自然風干、備用。

1.2.2 樣品提取液制備

每次稱取干燥藥材份1 g于三角瓶中，萃取樹莓葉中的黃酮類成分，經超聲提取后，抽濾，棄去固體殘渣，定容至50 mL，得黃酮粗提取液，備用。將脫脂的樹莓葉用體積分數為60%的乙醇溶液按料液比1∶20超聲提取60 min，抽濾，收集濾液將其定容至100 mL容量瓶中，備用。

1.2.3 定性檢測

1.2.3.1鹽酸—鎂粉反應

分別準確量取黃酮粗提取液和蘆丁溶液5 mL于試管中，加入少許鎂粉及鹽酸，搖勻，觀察反應顏色。

1.2.3.2與三氯化鋁的絡合反應

分別量取黃酮粗提取液和蘆丁溶液5 mL于試管中，加入1%三氯化鋁溶液，觀察顏色變化。

1.2.3.3與NaOH的反應

分別取樹莓葉黃酮提取液與蘆丁溶液5 mL，加入1 mL 4%的NaOH溶液，輕輕混勻，觀察現象。

1.2.3.4與濃硫酸的反應

分別取樹莓葉黃酮提取液與蘆丁溶液5 mL，加入1 mL濃硫酸，輕搖混勻，噴濾紙上吹干，觀察顏色變化，結果見表1。

1.2.4 定量檢測

采用蘆丁-分光光度法進行定量檢測。

1.2.4.1標準曲線的繪制

準確稱取在120 ℃條件下干燥至恒重的蘆丁標準品10.0 mg置于50.0 mL容量瓶中，約20.0 mL的無水乙醇溶解，再用30.0%的乙醇稀釋至刻度，配制成0.2 mg·mL-1的標準溶液。準確吸取上述蘆丁標準液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10.0 mL容量瓶中，各加入30.0%的乙醇5.0 mL，加入0.3 mL5.0%的NaNO2，搖勻后放置6 min，加入0.3 mL10.0%的Al（NO3）3，搖勻后再放置6 min，加入4.0%的NaOH溶液4.0 mL，分別用30.0%的乙醇定容，搖勻后放置15 min，以試劑空白作為參比，在510 nm處測吸光度A值。以濃度X（mg·mL-1）和吸光度A進行回歸分析，得回歸方程為A=11.935c+0.0255，R2=0.999 3。

1.2.4.2黃酮含量的測定

1.2.5 黃酮粗提液抗氧化性分析

1.2.6 黃酮純化及抗氧化的測定

將大孔樹脂在乙醇中浸泡、攪拌24 h，然后倒入柱子中，靜置24 h，期間確保乙醇的液面高于大孔樹脂的液面。一次性完成裝柱，靜置24 h，上樣，靜置，靜吸附24 h，靜置期間避免與空氣接觸。先用蒸餾水進行洗脫，洗至流出液無醇味為止，然后用體積分數為60%的乙醇溶液進行洗脫，洗至流出液顏色接近無色為止，收集流出液，并將洗脫液旋蒸至盡量少的濃稠液，將純化后的提取液進行抗氧化測定同2.5。

2 結果與分析

2.1 定性實驗

由于黃酮類化合物結構中同時含有堿性氧原子和酚羥基，能與金屬類試劑如鉛鹽、鋁鹽、鐵鹽和鎂鹽等形成有色絡合物，由顏色反應的結果可確定樹莓葉提取物中含有黃酮。結果見表1。

2.2 純化前后兩種樹莓葉的黃酮得率比較

兩種樹莓葉純化后的黃酮含量均有提高，黃樹莓得率從5.120%提高到11.381%，藍樹莓從9.517%提高到17.872%，結果見圖1。

2.3 純化前后清除率比較

2.3.1 紅樹莓葉純化前后對DPPH自由基的清除率

用不同濃度的紅樹莓葉粗提液及純化后的樣品液對DPPH自由基進行清除，紅樹莓葉黃酮提取物對DPPH自由基有很強的清除能力，且隨著黃酮含量的增加清除率增大。當提取液黃酮濃度同為0.02 mg·mL-1時，粗提物的清除率為59.92%，而純化物的清除率為83.28%。純化后的抗氧化能力明顯增加，結果見圖2。

2.3.2 黑樹莓提取液純化前后對DPPH自由基的清除率

黑樹莓葉黃酮提取物對DPPH自由基有很強的清除能力，且隨著黃酮含量的增加，清除率增大。當提取液黃酮濃度同為0.02 mg·mL-1時，粗提物的清除率為59.75%，而純化物的清除率為89.73%。純化后的抗氧化能力明顯增加，結果如圖3所示。

3 討論

本實驗根據超聲波提取樹莓葉黃酮類物質的最優條件進行黃酮提取，總黃酮提取液利用紫外分光光度計為200～600 nm時，發現其最大吸收峰在510 nm處，與蘆丁標準品溶液在510 nm處有最大吸收一致，說明實驗方法及過程基本正確。樹莓葉片中黃酮類化合物提取物對4種自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）均表現出一定的清除能力，且清除能力和黃酮類化合物的含量有關，含量越高，清除能力越強[5]。

通過樹莓葉粗提液純化前與純化后的得率進行比對可以看出，純化后的樹莓得率明顯高于純化前。樹莓葉純化物清除DPPH自由基的能力很強，且隨著黃酮加入量的增加，清除率增大;與粗提物相比，當清除率相同時，純化物加入量比粗提物加入量明顯少，含有相同黃酮量時，純化提取物清除DPPH自由基能力大于未純化提取物的清除能力，說明增大黃酮純度，清除DPPH自由基的能力也增大。由此提示樹莓葉黃酮提取后經純化再利用具有更好的應用前景。

參考文獻：

[1] 馬曉麗.生物類黃酮的研究進展[J].山西職工醫學院學報，2005，15（5）：70-73.

[2] Huntley A L.The Health Benefits of Berry Flavonoids for Menopausal Women： Cardiovascular Disease， Cancer and Cognition[J].Malturitas，2009，63（4）：297-301.

[3] 趙瑞艷，徐雅琴.樹莓葉片中黃酮類物質提取及抗氧化性研究[J].中國農學通報，2006，22（2）：104-106.

[4] 黃瓊，黎貴卿，陳海燕，林翠梧.超聲波法提取牡荊總黃酮的工藝及其抗氧化性的研究[J].安徽農業科學，2009，37（6）：2544-2545.

[5] 楊國慧，張巖，于洋，等.樹莓葉果黃酮類化合物含量及抗氧化性分析[J].湖北農業科學，2015，54（18）：4514-4518.

（責任編輯：劉昀）