胡椒酸乙二胺的急性毒性實驗研究

張瑞 韓加 呂梅霞 吾布力卡司木·艾克拜爾 彭冰鑫 吐爾孫拜克·葉爾達

基金項目：國家自然科學基金（21462046）。

作者簡介：張瑞（1994-），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為營養流行病。E-mail：544567951@qq.com

通信作者：吐爾孫拜克·葉爾達（1962-），男，蒙古族，博士，副教授，研究方向為天然產物化學。E-mail：cerendorj@126.com

【摘 要】 目的：研究胡椒酸乙二胺（PAE）的急性毒性作用及安全性。方法：40只昆明種小鼠隨機分成實驗組和對照組，各20只，實驗組用0.5% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制的PAE混懸液對小鼠進行灌胃，對照組用0.5% CMC-Na溶液灌胃，采用最大耐受量（MTD）法，給藥劑量為5g/kg，每天1次，連續14d，觀察給藥后小鼠有無異常反應及死亡情況，期間記錄體重變化，實驗結束解剖動物，稱量臟器濕重，計算臟器系數。結果：給藥后小鼠未出現死亡和毒性反應，解剖肉眼觀臟器未見病變，分析比較兩組小鼠體重、臟器濕重及臟器系數，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：胡椒酸乙二胺屬低毒性化合物。

【關鍵詞】 胡椒酸乙二胺;小鼠;急性毒性

【中圖分類號】R285.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）7-0021-03

Abstract：Objective To study the acute toxicity and safety of the piperic acid ethylenediamine （PAE）. Methods 40 Kunming mice were randomly divided into experimental group and control group， with 20 mice in each group. The experimental group was intragastrically administered with PAE suspension formulated with 0.5% Sodium carboxymethyl cellulose （CMC-Na）， and the control group was gavaged with 0.5% CMC-Na solution. Use the maximum tolerance method （MTD）， the intragastric dose was 5 g/kg， the mice were given by gavage once a day for 14 days， observed any adverse reactions and deaths after the treatment， and the body weight changes were recorded during the experiment. At the end of the experiment dissected the animal， weighed the wet weight of the organ， and calculated the organ coefficient. Results There was no death and toxicity in the mice after administration， and no pathological changes were observed in the naked eye， analysis and comparison of body weight， organ wet weight and organ coefficient of the two groups of mice， the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Piperonic acid ethylenediamine is a low toxicity compound.

Keywords：Piperic Acid Ethylenediamine （PAE）;? Mice; Acute Toxicity

胡椒堿是從胡椒蓽菱等中提取的有效成分，是中、蒙醫常用藥物。近年來，隨著社會經濟的發展和人們膳食結構的改變，血脂異常越來越常見。研究報道高脂血癥是動脈粥樣硬化和冠心病（CHD）的潛在危險因素[1]，嚴重威脅著人類健康。許多降高脂血癥西藥（如他汀類和貝特類藥物等）雖然降脂作用明顯，但同時有許多不良的反應[2]。天然藥用植物在促進人類健康和治療疾病方面起著關鍵作用，與合成藥物相比，藥用植物被認為毒性更低，并在調節血清TC、TG水平上發揮著有效的作用，因而對于藥用植物產品的研究已成為熱點[3]。研究表明[4-5]，胡椒堿及其衍生物具有顯著的降脂效果。但由于胡椒堿具有毒性，極大地限制了其臨床應用開發[6]。有研究發現胡椒堿的某些衍生物即具有良好調血脂效果且毒性較低[7]。胡椒酸乙二胺是新近合成的胡椒堿衍生物，為評價其安全性，并為其后續的藥用價值研究提供理論依據，本研究對胡椒酸乙二胺的急性毒性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠48只，SPF級，雌雄各半，體質量18～22g，購于新疆醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（新）2016-0003，使用許可證號：SYXK（新）2016-0002）。實驗動物在SPF級動物屏障實驗室內飼養，環境溫度20～25℃，相對濕度45%～80%。

1.2 受試物 胡椒酸乙二胺（piperic acid ethylenediamine，PAE）由新疆伊犁師范學院天然產物化學教研室合成提供。化學名稱：（2E，4E）-N-（2-氨基乙基-5-（苯并[d][1，3][二氧雜環戊烯]-5基）戊-2，4-二烯酰胺;英文名稱：（2E，4E）-N-（2-amino ethyl -5-（benzo[d][1，3][dioxol]-5-yl）penta-2，4-dien acid amide。

1.3 實驗方法

1.3.1 預實驗 胡椒酸乙二胺不溶于水，可溶解于質量分數為0.5%的CMC-Na溶液，將其配成最大溶解度為0.165g/mL的均勻混懸液。隨機抽取8只小鼠，分成兩組（實驗組和對照組），雌雄各半，每組4只，適應性飼養1 周，禁食不禁水12h后，實驗組以小鼠灌胃可承受的最大體積（0.8mL/20g）灌胃PAE混懸液，即相當于胡椒酸乙二胺6.6g/kg，對照組灌胃等體積的0.5% CMC-Na。灌胃給藥后兩組均自由攝食及飲水，密切觀察30min，再于給藥2h后觀察一次，之后每天觀察1次，連續觀察7d。測量胡椒酸乙二胺對實驗小鼠的半數致死量（LD50）。

1.3.2 正式實驗 40只小鼠隨機分為兩組（實驗組和對照組），雌雄各半，每組20只，適應性飼養1周，灌胃前禁食不禁水12h。根據預實驗結果，正式實驗采用最大給藥量法[8]。以小鼠可承受的0.6mL/20g的灌胃體積，灌胃0.165g/mL的PAE均勻混懸液，即相當于胡椒酸乙二胺5g/kg，對照組灌胃等體積的0.5% CMC-Na。連續觀察14d，期間記錄給藥前后小鼠的死亡及其他異常情況，包括小鼠的反應、活動、皮毛光澤度、攝食量、分泌物、糞便等，觀察結束時測小鼠體重，解剖并觀察各主要臟器顏色、形態，稱量肝臟腎臟質量并計算臟器系數。各臟器系數（%）=臟器重量（g）/體重（g）×100。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據處理和分析，計量資料數據以均數加減標準差（x[TX-*3]±s）表示。服合正態分布的數據兩組比較采用兩獨立樣本的t檢驗，多組比較采用方差分析;不服合正態分布的用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預實驗 與對照組比較，整個實驗期間實驗組小鼠毛色、行為、進食、飲水、糞便等未見異常，也未見小鼠流淚、有眼屎、呼吸困難等異常生理現象。觀察期間小鼠全部存活，體重正常增長，未能測出半數致死量（LD50）。觀察期結束，小鼠全部頸椎脫臼處死，解剖觀察內臟器官，肉眼觀未見心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等臟器有異常變化。

2.2 正式實驗 與對照組小鼠相比，給藥后2周內，實驗組小鼠未見任何中毒癥狀和死亡情況，觀察期間小鼠中樞神經系統及神經肌肉系統、植物神經系統、呼吸系統、糞便硬度和顏色、皮膚和被毛、行為活動均未見異常。實驗組小鼠體重與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），見表1。觀察期結束，解剖觀察未見內臟器官有異常變化，實驗組臟器系數與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

胡椒是東南亞國家最受歡迎的香料產品之一[9]。傳統醫學可用于治療瘧疾和癲癇[10]，胡椒的果實可用于治療霍亂和消化不良等胃腸道疾病[11]。胡椒堿是胡椒中含量最大、活性最高的生物堿[12]，是黑胡椒和長胡椒的酚類成分[13]。胡椒堿不僅可用作調味品，還具有止痛、降血脂[14]、抗炎（包括胃潰瘍[15]、關節炎[16]和內毒素誘導的休克[17]）、抗驚厥、抗氧化、抗抑郁[18]、抗癲癇[19]和增強認知功能[20]的作用，此外胡椒堿也可減輕肥胖癥和糖尿病的發生[21-22]。

急性毒性實驗是研究動物一次或24h內多次給予受試物后，一定時間內所產生的毒性反應。對于某些低毒的受試物可采用最大給藥量法[8]，即在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，以允許的最大劑量單次給藥或24h內多次給藥（劑量一般不超過5g/kg BW），觀察動物出現的反應。根據受試物性質、預實驗結果，并參考其他胡椒堿衍生物急性毒性資料[5]，胡椒酸乙二胺毒性極小，故本實驗中急性毒性實驗采用動物最大劑量法（最大使用濃度和最大灌胃體積）[23-24]。整個實驗過程中未見小鼠死亡及中毒癥狀，體重自然增長，說明胡椒酸乙二胺對小鼠體重無不良影響。解剖肉眼觀小鼠內臟均未發現異常改變，統計分析兩組臟器系數無明顯差異，說明胡椒酸乙二胺對小鼠內臟無影響。提示胡椒酸乙二胺屬低毒性的化合物，研究為后期胡椒酸乙二胺進一步的藥用開發和臨床應用提供了科學依據。

參考文獻

[1]Navar-Boggan AM， Peterson ED， Sr DR， et al. Hyperlipidemia in early adulthood increases long-term risk of coronary heart disease[J]. South China Journal of Cardiology， 2015， 131（1）：451-458.

[2]Li M， Shu X， Xu H， et al. Integrative analysis of metabolome and gut microbiota in diet-induced hyperlipidemic rats treated with berberine compounds[J]. Journal of Translational Medicine， 2016， 14（1）：237-249.

[3]Sham TT， Chan CO， Wang YH， et al. A Review on the Traditional Chinese Medicinal Herbs and Formulae with Hypolipidemic Effect[J]. Biomed Research International， 2014（10）：1155-1175.

[4]吐爾孫拜克·葉爾達，納森巴特.胡椒堿合成胡椒酸己二胺的中試放大研究[J].中國石油和化工標準與質量，2014，2（24）：64-65.

[5]徐抒，吐爾孫拜克·葉爾達，鐵日格力，等.胡椒酸己二胺降血脂及抗氧化作用的實驗研究[J]. 河北醫學， 2016， 22（5）：868-870.

[6]阿榮，喬延江，博格日勒圖， 等.蓽茇寧衍生物對高脂血癥大鼠調脂作用及其機制的研究[J].安徽醫藥，2015，19（8）：1446-1449.

[7]張桂秋，李丹，楊異卉.胡椒堿衍生物的化學合成及生物活性研究進展[J].中國臨床藥理學雜志，2017，33（14）：1374-1378

[8]李鳳奎，王純耀. 實驗動物與動物實驗方法學[M]. 鄭州：鄭州大學出版社， 2007.

[9]Zarai Z， Boujelbene E， Ben Salem N， et al. Antioxidant and antimicrobial activities of various solvent extracts， piperine and piperic acid from Piper nigrum[J]. LWT-Food Sci Technol，2013（50）：634-641.

[10]Majeed M， Prakash L. The medical uses of pepper[J]. Int Pepper New，2000（25）：23–31.

[11]Jung BS， Shin MK. Encyclopedia of illustrated Korean natural drugs，Araliaceae[J]. Seoul： Young Lim Sa， 1998：439-443.

[12]Thiel A，Buskens C，WoehBe T，et a1. Black pepper constituent piperine：Genotoxicity studies in vitro and in vivo[J]. Food and Chemical Toxicology， 2014，66（4）：350-357.

[13]Srinivasan K. Black pepper and its pungent principle-piperine： a review of diverse physiological effects[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition， 2007， 47（8）：735-748.

[14]Jwa H， Choi Y， Park UH， et al. Piperine， an LXRalpha antagonist， protects against hepatic steatosis and improves insulin signaling in mice fed a highfat diet[J]. Biochem Pharmacol， 2012，84（11）：1501-1510.

[15]Bai YF ， Xu H. Protective action of piperine against experimental gastric ulcer[J]. Acta Pharmacol Sin， 2000，21（4）：357-359.

[16]Umar S， Golam Sarwar AH， Umar K， et al. Piperine ameliorates oxidative stress， in ammation and histological outcome in collagen induced arthritis[J]. Cell Immunol ， 2013（284）：51-59.

[17]Bae GS， Kim MS， Jung WS， et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced in ammatory responses by piperine. Eur J Pharmacol， 2010（642）：154-162.

[18]Lucian Hritcu， Jaurès A Noumedem，Oana Cioanca， et al. Anxiolytic and antidepressant profile of the methanolic extract of Piper nigrum fruits in beta-amyloid （1-42） rat model of Alzheimer's disease[J]. Behavioral & Brain Functions， 2015， 11（1）：1-13.

[19]Wattanathorn J， Chonpathompikunlert P， Muchimapura S， et al. Piperine， the potential functional food for mood and cognitive disorders[J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association， 2008， 46（9）：3106-3110.

[20]Diwan V， Poudyal H， Brown L. Piperine attenuates cardiovascular， liver and metabolic changes in high carbohydrate， higIl fat-fed rats[J]. Cell Biochemistry and Biophysics， 2013， 67（2）：297-304.

[21]Choi S， Choi Y， Kim S， et al. Piperine reverses high fat diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance in mice[J]. Food Chemistry， 2013， 141（4）：3627-3635.

[22]Nogara L， Naber N， Pate E， et al. From the Cover： Piperines mitigation of obesity and diabetes can be explained by its up-regulation of the metabolic rate of resting muscle[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2016， 113（46）：13009-13014.

[23]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全性毒理學評價程序：GB 15193.1-2014[S].北京：中國標準出版社， 2014.

[24]孫玉珍， 方毅， 李書丹，等. 紅樹莓根莖水煎劑對昆明小鼠的急性毒性及安全性實驗研究[J]. 中醫藥學報， 2018，46（3）：58-61.

（收稿日期：2019-01-22 編輯：程鵬飛）