甘草酸對巨噬細胞抗綿羊肺炎支原體感染的調控作用研究

高力揚，張 凱，王巧輝，裴佳瑞，馬澤華，李 敏*

1寧夏大學生命科學學院 寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室；2寧夏大學新華學院，銀川750021

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)是引起綿羊、山羊傳染性胸膜肺炎及增生性間質性肺炎的病原體，對寧夏灘羊養殖業危害較大。大環內酯類抗生素、泰樂菌素、紅霉素及阿奇霉素等對綿羊支原體肺炎具有減緩病情的作用，但無法根治該病，而且易產生耐藥性。以往研究發現支原體對機體有免疫抑制作用，主要體現在：促進巨噬細胞凋亡[1,2]，影響炎癥因子表達[3,4]，抑制巨噬細胞自噬[5]。甘草酸提取于甘草根部，是甘草中最主要的活性成分，可溶于水，分子式為C42H62O16，可以水解為2分子葡萄糖醛酸和1分子甘草次酸。目前研究顯示甘草提取物有抑菌能力[6,7]，增強雞巨噬細胞吞噬和清除胞內沙門氏菌的能力[8]，對治療病毒性肝炎[9]、抑制銅綠假單胞菌[10]、雞混合艾美耳球蟲感染的免疫調節有一定作用[11]，而且可以抑制豬嗜血支原體對紅細胞的黏附[12]。然而甘草酸對天然免疫細胞的影響尚不明確，因此本研究聚焦甘草酸在巨噬細胞抗MO感染中發揮的作用，為利用增強天然免疫的方式來預防綿羊支原體肺炎提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

胎牛血清購自全式金公司，高糖DMEM、胰酶、PBS購自Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗、馬血清購自Solarbio公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；mRNA提取試劑盒購自OMEGA公司；凋亡及自噬相關基因引物由Sangon Biotech公司合成；Real-time PCR相關試劑盒購自TaKaRa公司；Bad抗體、Bax抗體、腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測試劑盒、Western Blot顯色劑、DMSO、NanoDrop 8000設備、QuantStudio 5設備購自Thermo Fisher公司；GAPDH購自北京義翹神州科技有限公司；支原體培養基基礎、支原體肉湯培養基購自青島海博生物技術有限公司；甘草酸使用PBS配制為12、1.2、120、12 μM濃度。全波段酶標儀購自美國BIO-RAD公司；CO2細胞培養箱購自日本SANYO公司；多模式微孔板檢測儀購自PerkinElmer公司；流式細胞儀購自德國Sysmex公司。

1.2 甘草酸的配制

稱取甘草酸粉末溶于溫PBS中，渦旋震蕩溶解后用0.22 μm的過濾器過濾，配制成終濃度為120 mM的甘草酸儲存液，4 ℃保存。

1.3 實驗分組

本實驗一共分為對照組、甘草酸處理組、MO感染組、甘草酸/MO感染組。其中對照組及MO感染組分別加入與甘草酸處理組、甘草酸/MO感染組稀釋前甘草酸儲存液相同體積的PBS緩沖液作為參照。

1.4 細胞培養

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的高糖DMEM培養液于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。1～2天進行傳代處理，取生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.5 CCK-8細胞活性檢測

接種2 000～5 000個細胞懸浮于100 μL培養基中，接種于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h，每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，于培養箱內孵育1～4 h后用全波段酶標儀450 nm波長處測定吸光值。

1.6 Western blot

將各個分組中細胞裂解后采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，配平后加入蛋白上樣緩沖液金屬浴100 ℃保持5 min。Bad、Bax、GAPDH一抗1∶1 000稀釋，4 ℃下孵育12 h，二抗1∶10 000稀釋后室溫下孵育2 h后上機檢測。

1.7 Real-time PCR

將各個分組中細胞裂解后采用mRNA提取試劑盒對細胞mRNA進行提取， NanoDrop 8 000進行濃度測定后利用反轉錄試劑盒反轉錄獲取cDNA，按照TaKaRa Real-time PCR試劑盒說明利用QuantStudio 5設備對凋亡及自噬相關基因表達量進行測定。

1.8 ELISA

取各個分組細胞培養上清用于ELISA檢測，TNF-α檢測步驟參照試劑盒內說明書，酶標儀讀取450 nm處OD值。

1.9 細胞周期檢測

實驗分為2組，分別為對照組和甘草酸處理組，培養24 h后收集細胞于1 mL預冷的70%乙醇中-20 ℃固定一夜。采用細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒處理兩組細胞，然后用流式細胞儀檢測細胞周期。

表1 Real-time qPCR引物序列Table 1 The Real-time qPCR primer sequences

1.10 MO培養

支原體培養基基礎33 g溶解于1 L蒸餾水中，高壓后冷卻至室溫，加入20%馬血清、80萬單位氨芐青霉素、1%醋酸鉈10 mL，充分混勻后分裝于50 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱保存。Y98標準株培養于37 ℃，5% CO2培養箱中，待培養基顏色由紅色變為橙黃色(pH6.8)左右時1∶5傳代培養。MO濃度采用顏色變化單位測定法(colour change unit,CCU)計算，即十倍梯度稀釋MO菌液后觀察MO培養基顏色變化，以最后發生顏色改變的稀釋倍數為待檢的MO菌液的CCU。

1.11 甘草酸處理RAW264.7

將預先配置好的甘草酸儲存液用新鮮的細胞培養液稀釋到合適濃度，然后用稀釋好的甘草酸對待處理細胞進行換液處理，空白對照組將所用甘草酸儲存液相應體積的PBS用新鮮培養液進行同比稀釋處理并對待處理細胞進行換液。

1.12 MO侵染RAW264.7

RAW264.7細胞對數生長時，以5×106的密度接種于10 cm細胞培養皿中，待細胞貼壁且生長狀態良好，12 000 rpm，10 min離心收集MO并用新鮮細胞培養液將MO重懸后按感染復數MOI=10∶1加入待感染的細胞，并置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h后分別提取各個分組細胞的總蛋白及總mRNA進行后續實驗。

1.13 統計學分析

統計學軟件采用GraphPad Prism 7.04，兩組數據之間采用T tests非參數檢驗法統計，三組及三組以上數據采用單因素方差分析法進行統計學分析。

2 結果

2.1 甘草酸對巨噬細胞RAW264.7的毒性檢測

為了驗證不同濃度甘草酸對巨噬細胞活性的影響，我們采用12、1.2、120、12 μM濃度的甘草酸-PBS溶液處理RAW264.7細胞，培養24 h后用CCK-8法檢測細胞活性(圖1)。結果顯示與對照組相比濃度為120、12 μM的甘草酸顯著提高RAW 264.7巨噬細胞活性(P<0.000 1，P=0.012 9)；而12、1.2 mM高濃度甘草酸與對照組相比顯著抑制RAW264.7巨噬細胞存活(P<0.000 1)。因此本實驗采用最小濃度12 μM甘草酸溶液處理細胞。

圖1 篩選適合RAW264.7巨噬細胞的甘草酸處理濃度Fig.1 Optimal concentation for glycyrrhizic acid to treat RAW264.7 macrophages.注：(120 μmol/L)*** P <0.000 1 vs對照組；(12 μmol/L) * P=0.012 9 vs對照組；(12 mmol/L、1.2 mmol/L) *** P <0.000 1 vs對照組。Note：(120 μmol/L)*** P <0.000 1 vs Control；(12 μmol/L) * P=0.012 9 vs Control；(12 mmol/L、1.2 mmol/L) *** P <0.000 1 vs Control.

2.2 甘草酸對RAW 264.7巨噬細胞細胞周期的影響

圖2為流式細胞儀檢測甘草酸處理前后RAW264.7巨噬細胞周期，結果顯示：與未處理組相比甘草酸處理后，處于G1期的細胞數量減少，S期細胞數量減少，G2期細胞數量增加。

2.3 甘草酸對受MO感染的RAW 264.7巨噬細胞細胞活性的影響

取CCU濃度為1×107生長良好的MO，按照 MOI值為10∶1感染RAW264.7細胞。實驗分為無感染對照組，MO感染組，經甘草酸處理的MO感染組，分別培養24 h后檢測細胞活性。結果顯示與對照組相比24 h內MO沒有顯著抑制RAW264.7的生長(P=0.659 4)，加入甘草酸組中RAW264.7巨噬細胞增殖顯著增加(P=0.021 7，圖3)。

圖2 甘草酸處理前后巨噬細胞周期。Fig.2 Cell cycle in non-treated and glycyrrhizic acid treated macrophages注：左側為未處理組，右側為甘草酸處理組。Note：The left side is the untreated group,and the right side is the glycyrrhizic acid treated group.

圖3 甘草酸對受MO感染的RAW264.7巨噬細胞活性的影響。Fig.3 Effect of glycyrrhizic acid on cell viability of MO-infected RAW264.7 macrophages注：P=0.659 4 MO感染組 vs對照組； *P=0.021 7 甘草酸+MO組vs對照組。Note：P=0.659 4 MO treated vs Control; *P=0.021 7 glycyrrhizic acid+MO treated vs Control.

2.4 甘草酸調控MO感染后巨噬細胞中TNF-α的分泌

為了驗證甘草酸對巨噬細胞炎癥因子分泌的影響，本實驗采用ELISA分析巨噬細胞上清液中的TNF-α的表達量(圖4)。結果顯示與對照組相比MO感染后巨噬細胞TNF-α的表達量顯著下降(P<0.000 1)，而正常巨噬細胞在甘草酸處理后TNF-α的表達量也會顯著降低(P=0.009 7)，但加入甘草酸的巨噬細胞被MO感染后，細胞上清中TNF-α表達量有所上升(P<0.05)。

2.5 甘草酸對受MO感染后巨噬細胞凋亡相關基因的表達的影響

為了研究MO對巨噬細胞凋亡的影響，以及甘草酸在此過程中的作用，本實驗采用Real-time PCR法檢測凋亡相關基因caspase 3、caspase 8、caspase 9的表達情況(圖5)。結果顯示，與Control組相比巨噬細胞中凋亡相關基因caspase 3的表達在MO感染后上調(P<0.000 1)，caspase 8無顯著變化(P=0.347 9)，caspase 9表達量下調(P<0.000 1)。與MO組相比受MO感染的巨噬細胞中經甘草酸處理后caspase 3、caspase 8的表達量均顯著下調(P<0.000 1)，caspase 9則無顯著變化(P=0.424 6)。

圖4 巨噬細胞培養上清中TNF-α的分泌Fig.4 Secretion of TNF-α in macrophage culture supernatant注： ***P <0.000 1 MO感染組 vs對照組；**P =0.009 7甘 草酸組 vs對照組；*P <0.05 MO感染組vs甘草酸+MO組。Note： ***P <0.000 1 MO treated vs Control；**P =0.009 7 glycyrrhizic acid treated vs Control； *P <0.05 MO treated vs glycyrrhizic acid+MO treated.

2.6 甘草酸對受MO感染后巨噬細胞凋亡相關蛋白的表達的影響

為了進一步研究MO對巨噬細胞凋亡的影響，以及甘草酸在此過程中的作用，本實驗采用Western blot法檢測凋亡蛋白Bax、Bad的表達情況(圖6)。結果顯示，與對照組相比巨噬細胞中促凋亡蛋白Bax的表達在MO感染后上調，而加入甘草酸處理不會引起正常巨噬細胞Bax蛋白的表達，但在受MO感染的巨噬細胞中，甘草酸不能改善MO引起的巨噬細胞Bax蛋白表達(P= 0.076 3)。Bad蛋白在正常巨噬細胞中弱表達，在MO處理組中無表達，但甘草酸處理組表達量較高(P<0.000 1)。

圖5 凋亡相關基因在巨噬細胞中的表達情況。Fig.5 Expression of apoptosis-related genes in macrophages.注：(Caspase 3)***P <0.000 1；(Caspase 8)P =0.347 9；(Caspase 9)****P <0.000 1 MO組vs Control。 (Caspase 3、Caspase 8)****P <0.000 1；(Caspase 9)P =0.424 6 MO/甘草組vs MO組。Note：(Caspase 3)***P <0.000 1；(Caspase 8)P =0.347 9；(Caspase 9)****P <0.000 1 MO treated vs Control.(Caspase 3、Caspase 8)****P <0.000 1；(Caspase 9)P =0.424 6 MO/ glycyrrhizic acid treated vs MO treated.

圖6 促凋亡因子在巨噬細胞中的表達情況。Fig.6 Expression of pro-apoptotic factors in macrophages.(A) images of Western blot results.(B) quanlitative analysis of bands by ImageJ software.注：(Bax)P = 0.076 3 MO組 vs甘草酸/MO組；(Bad)****P <0.000 1 對照組vs甘草酸。Note：(Bax)P = 0.076 3 MO treated vs MO/ glycyrrhizic acid treated；(Bad)****P <0.000 1 Control vs glycyrrhizic acid treated.

2.7 甘草酸對受MO感染后巨噬細胞自噬相關基因的表達的影響

為了研究MO對巨噬細胞自噬的影響，以及甘草酸在此過程中的作用，本實驗采用Real-time PCR法檢測自噬相關基因Atg 7、Beclin 1的表達情況(圖7)。結果顯示，與Control組相比受MO感染的巨噬細胞中經甘草酸處理后自噬相關基因Atg 7的表達量顯著上調(P<0.000 1)，Beclin 1表達量顯著上調(P=0.001 6)；與MO組相比MO/甘草酸組自噬相關基因Atg 7、Beclin 1的表達量均顯著上調(P<0.000 1)。

3 討論

研究結果顯示，高濃度甘草酸溶液對細胞有抑制作用，但12 μmol/L甘草酸溶液可以促進RAW264.7巨噬細胞增殖。以往研究發現支原體感染可使巨噬細胞活力下降，感染后期巨噬細胞凋亡，從而破壞宿主免疫系統對原發感染和繼發感染的控制，使得炎癥得以擴散和蔓延[13]。甘草酸處理后細胞周期G1期、S期細胞數量減少，而進入G2期的細胞數量增加，結合細胞增殖檢測，提示甘草酸可能通過調節細胞周期來促進巨噬細胞的細胞增殖，從而對巨噬細胞抗MO感染有一定積極作用。在細胞凋亡方面，caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發的級聯反應是介導細胞凋亡的中心環節，通過選擇性地切割某些蛋白質使靶蛋白活化或失活，從而介導下游的細胞凋亡過程[14,15]。本實驗驗證了caspase家族的重要成員caspase 3，caspase 8，caspase 9在甘草酸參與的巨噬細胞應對MO感染中的作用。實驗發現甘草酸可以抑制凋亡基因caspase 3、caspase 8、caspase 9在正常巨噬細胞中的表達。 蛋白檢測發現促凋亡因子Bax表達在正常組和甘草酸處理組均無明顯表達，而在MO處理后表達量明顯升高，提示MO感染可能會引起巨噬細胞凋亡。實驗結果提示甘草酸處理可以減少巨噬細胞凋亡因子的表達，從而增加MO處理后的巨噬細胞活性。

圖7 自噬相關基因在巨噬細胞中的表達情況Fig.7 Expression of autophagy-related genes in macrophages注：(Atg 7)****P<0.000 1；(Beclin 1)**P =0.001 6 MO/甘草酸組 vs Control。(Atg 7、Beclin 1) ****P<0.000 1 MO/甘草酸組 vs MO組。Note：(Atg 7)****P<0.000 1；(Beclin 1)**P =0.001 6 MO/ glycyrrhizic acid treated vs Control.(Atg 7、Beclin 1) ****P<0.000 1 MO/ glycyrrhizic acid treated vs MO treated.

本課題組前期研究發現，MO可能通過抑制巨噬細胞自噬而減少巨噬細胞對MO的清除[5]。Bad蛋白在促凋亡和激活自噬中均發揮作用，本實驗中Bad在正常組中表達，在甘草酸處理組中高表達，而在MO感染組中均無表達，提示甘草酸可能在激活巨噬細胞自噬中發揮作用。因此本實驗對自噬相關基因進行驗證。自噬基因Beclin 1 和Atg 7表達變化說明，正常情況下甘草酸處理和甘草酸處理后經MO感染情況下，都可以引起自噬相關蛋白編碼基因的高表達，結果提示甘草酸可能對巨噬細胞自噬有一定正向調控作用。

巨噬細胞可吞噬病原微生物，放大炎癥信號，并通過抗原遞呈調節T細胞應答參與獲得性免疫應答[16,17]。 TNF-α主要由活化的巨噬細胞產生，可以誘導T細胞及NK細胞增殖活化[18,19]，及促進單核細胞白血病細胞U937向巨噬細胞分化[20]，而且TNF-α能有效刺激肺泡上皮細胞A549產生過度炎癥反應[21]。本實驗發現MO可以抑制巨噬細胞分泌TNF-α，可能是MO對巨噬細胞免疫抑制的一個體現。然而甘草酸處理過的巨噬細胞在受到MO感染后，其TNF-α分泌量顯著回升。

綜上所述，甘草酸可以抑制受MO感染后巨噬細胞的凋亡，并且可以增加巨噬細胞增殖，而且甘草酸可以促進受MO感染的巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α，除此之外，甘草酸可能通過對巨噬細胞自噬產生激活作用，從而在消除MO感染中發揮作用。