基于QuEChERS-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法測定醬油類調味品中的氨基甲酸乙酯

黃秋婷，王成龍，王宇,2，戚平，宋安華*

(1.廣州市食品檢驗所，廣州 510410；2.廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528437)

醬油是中國家庭必不可少的調味料，在日常烹飪中需求量大。但在其生產工藝，豆制品發酵過程中，尿素或瓜氨酸會與乙醇反應，產生一種2A類致癌性化學污染物氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)[1]。醬油是發酵食品中EC的主要來源之一，陽性率和污染水平均位于前列，甚至高于酒精飲料，存在較高的食品安全風險[2,3]。

目前檢測發酵食品中氨基甲酸乙酯常用的方法有高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)以及液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)等[4-6]。發酵食品的基質較飲料酒更為復雜，液相色譜法存在較強的雜質干擾，易出現假陽性；采用LC-MS法或GC-MS法時，因EC分子量小，碎片特征性不足，導致背景噪音大，方法特異性較差。

本文針對醬油類樣品的特點，采用優化的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)[7]前處理方案，建立了四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜測定醬油中EC的方法。在測定中，考察了該檢測方法應用于不同類型醬油產品中的基質效應，探討了氨基甲酸乙酯的分子裂解規律，為研究降低醬油中氨基甲酸乙酯測定的基質效應提供了理論分析參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及設備

UPLC-Q-Exactive超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher公司；Multi Reax渦旋振蕩器 德國Heidolph公司；Synergy超純水系統 法國Millipore公司；MS 3 Digital渦旋混合器 德國IKA公司；2600TH超聲波清洗器、0.22 μm水相濾膜 上海安譜儀器公司；AllegraX-30R高速離心機 美國Beckman Coulter公司；Poroshell 120 EC-C18色譜柱 美國Agilent公司。

1.2 試劑與樣品

甲醇、乙腈：色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；冰乙酸：分析純，廣州化學試劑廠；QuEChERS商用凈化管：含N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB)、無水硫酸鎂(MgSO4)：美國Agilent公司；氨基甲酸乙酯(EC，純度99%)：美國Aladdin工業公司；氨基甲酸乙酯內標(EC-D5，純度99.6%)：天津阿爾塔有限公司；實驗室用水為超純水；醬油樣品：均購自廣州市內超市。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準儲備液的配制

準確稱取EC和EC-D5標準品約10.0 mg，分別用乙腈溶解，然后轉移至100 mL棕色容量瓶中定容，分別配制成100 mg/L的標準儲備液，保存于4 ℃。根據試驗情況，使用超純水逐級稀釋成適當濃度的工作液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取約5.00 g樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入同位素內標EC-D5標準工作液，再加入10 mL乙腈，于渦旋振蕩器上混勻提取10 min后，在6000 r/min的條件下冷凍離心3 min，待凈化。

1.3.3 凈化

取上層有機液5 mL，置于15 mL QuEChERS基質分散固相萃取凈化管 (含400 mg PSA、400 mg C18、45 mg GCB以及1200 mg MgSO4)中，于渦旋振蕩器上混勻，在6000 r/min的條件下離心3 min，取凈化后的上清液1 mL，加水定容至5 mL，過0.22 μm水相濾膜，濾液待UPLC-MS進樣分析。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 色譜分析條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相：A為0.1%乙酸水(V/V)，B為乙腈，等度洗脫(95%+5%，體積比)；進樣量：5 μL；進樣器溫控：20 ℃；流速：0.25 mL/min；柱溫：20 ℃。

1.4.2 質譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：350 ℃；接口溫度：320 ℃；噴霧電壓：3000 V(正離子模式)；一級質譜全掃描分辨率：70000；掃描范圍：m/z 50～750； C-trap最大注入時間：50 ms；C-trap最大容量(AGC target)：1×106； PRM二級子離子全掃描分辨率：17500；二級C-trap最大容量：2×105；二級C-trap注入時間：100 ms；階越式碰撞能(stepped NCE)：(25±15)%；定性離子對和定量離子對等質譜參數及保留時間見表1。

表1 EC和EC-D5的分子式及質譜參數Table 1 Molecular formulas and mass parameters of ethyl carbamate(EC)and EC-D5

2 結果與討論

2.1 前處理方法優化

2.1.1 萃取溶劑選擇

實驗選用乙腈作為萃取試劑。EC水溶性好，乙腈對此類極性強的小分子化合物有較好的溶解性。此外，乙腈能對醬油基質有較好滲透，同時保證了提取較少親脂性干擾物。醬油類樣品含有大量的食鹽，經鹽析，乙腈層會與水相分層，該萃取過程有助于乙腈層保留較少的糖類與色素類雜質。

2.1.2 QuEChERS凈化方法優化

目前QuEChERS凈化方法使用的吸附劑主要是PSA、GCB、C18這3種物質，根據不同樣品基質特點來單獨或組合使用，以達到凈化的目的。有研究人員利用Box-Behnken Design建模法[8]、Full Factorial Design全篩法等[9]實驗優化吸附劑的組合，使凈化效果最佳，并最終確立推廣了一系列商業化的QuEChERS凈化包，能針對各果蔬基質的主要干擾物進行相對應的凈化。但醬油的成分相對于果蔬更為復雜，除含食鹽外，還有多種氨基酸、糖類、有機酸、色素及香料等成分。老抽醬油還添加了焦糖，其樣品顏色濃、粘稠度大，增加了樣品凈化難度。

因此，基于實驗成本、效率考量，以老抽為樣品基質，選擇目前流通的各商業化QuEChERS凈化方案(吸附劑凈化方案A：填料含400 mg PSA、400 mg GCB、1200 mg MgSO4；方案B：含150 mg PSA、900 mg MgSO4；方案C：含400 mg PSA、400 mg C18、45 mg GCB、1200 mg MgSO4；方案D：含50 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4)開展實驗。通過比較采用不同凈化方法下EC加標的絕對回收率(加標濃度為5 μg/kg，外標法定量)、除色效果、凈化液與空白處理液的EC-D5峰面積比值(因EC在樣品中存在本底，故采用EC-D5)，綜合得出醬油測定的最佳凈化方法。

表2 不同凈化方法下EC的加標回收率 與EC-D5峰面積比值Table 2 Spike recoveries of EC and peak area comparisons of EC-D5 by various purification methods

圖1 不同凈化方案的除色效果比較Fig.1 Comparison of color removal effect by various purification methods

由表2和圖1可知，凈化方案C除色效果最佳，且凈化后的目標物峰響應有顯著增強，同時也能滿足EC的加標回收要求。因此，QuEChERS凈化方案C可應用于醬油基質EC的測定。

2.2 基質效應評價

基質效應是指樣品中除了目標分析物以外的其他成分對待測物濃度的影響，即基質對分析方法準確性的干擾[10]。高分辨質譜具有高分辨率和高靈敏性的特點，易受共流出物干擾及離子化效率的影響，在定量分析時需充分考慮樣品基質效應。EC在醬油樣品中存在本底值，因此使用EC的內標化合物EC-D5開展醬油基質效應評價實驗。

以空白樣品配制濃度為20 ng/mL的EC-D5標準溶液。取市售常見的醬油品種(燒烤汁、老抽、壽司醬油、生抽)，按照1.3.2和1.3.3方法提取凈化，再用凈化后的各樣品處理液分別配制相同濃度的EC-D5基質標準溶液，每種醬油做6個基質平行。檢測方法的基質效應(Matrix Effect)以基質標準溶液和溶劑標準溶液的EC-D5峰面積的比值來表示，即ME=(基質中分析物的峰面積÷純溶劑分析物的峰面積-1)×100[11]。評價基質效應時，6個基質平行結果舍去最大值和最小值后，計算平均值。若ME>0，則表示該基質對EC存在基質增強效應，反之若ME<0，則表示該基質對EC存在基質抑制現象。不同醬油基質的基質效應見圖2。

圖2 醬油中EC測定的基質效應Fig.2 Matrix effect of EC detection in soy sauce

由圖2可知，各醬油|ME|≤20%，其數值在誤差區間浮動之內，實驗方法對各醬油基質均無基質效應[12]。

2.3 色譜與質譜條件優化

氨基甲酸乙酯為一種有機堿，流動相呈酸性時，能提升離子化效率且使峰形對稱，因此流動相水相選取了0.1%乙酸水；此外，EC極性較強，一般的反相柱難以保留，該方法采用全多孔硅膠核殼柱Poroshell 120 EC-C18，柱溫設為20 ℃，流動相以柱子可耐受的較高比例水相：乙酸水-乙腈(95%+5%)等度洗脫[13]。EC和EC-D5色譜保留較好，峰形對稱，見圖3。

圖3 EC和EC-D5平行反應監測(PRM)色譜圖Fig.3 Parallel reaction monitoring (PRM) of EC and EC-D5

EC這類小分子化合物，結構相對簡單，能形成較穩定的準分子離子峰[M+H]+(m/z 90.06496)。為在定量上能有較好的重現性，選擇平行反應監測模式(PRM)進行測定：四級桿過濾后，階躍式碰撞能(NCE)碎裂并疊加，高分辨的二級子離子完成專屬定量。對于較明顯的二級碎片離子進行分子擬合，同位素模擬，并篩選特征碎片，根據精確分子量的質量差推斷出該小分子的裂解方式[14]，見圖4和圖5。

圖4 測定的同位素分布(a)與EC的特征碎片 離子元素組成分析(b)Fig.4 Determination of isotope distribution (a) and element composition analysis of fragment ions of EC (b)

圖5 EC的MS2裂解模式Fig.5 MS2 fragmentation pattern of EC

注：rHB表示電荷中心引發的重排(α，β)；rHC表示電荷中心引發的重排(γ)。

[CH4O2N]+(m/z 62.02378)作為特征離子，是EC化合物的定性和定量離子，在高分辨質譜中能找到該離子A1同位素峰，符合圖5中MS2的裂解規律。

2.4 線性參數及檢出限、定量限

取EC及EC-D5標準儲備液加超純水，配制成EC-D5的質量濃度均為20 μg/L，EC質量濃度分別為1，2，5，10，20 μg/L的標準工作液。按1.3和1.4所述方法條件進行測定，獲得峰面積，采用最小二乘法進行回歸分析，其中x為EC質量濃度與內標EC-D5質量濃度的比值，y為EC峰面積與內標EC-D5峰面積的比值，得到在1～20 μg/L范圍內EC的線性回歸方程y=-0.00573311+0.0425925x，相關系數(r2)為0.9997，線性關系良好。檢出限(LOD，S/N=3)為0.5 μg/kg，定量限(LOQ，S/N=10)為1.5 μg/kg。

2.5 方法回收率及精密度

取不同基質類型的醬油樣品，分別進行加標回收實驗，EC加標水平分別為5，50 μg/kg，內標化合物EC-D5的加標水平為20 μg/kg，每個濃度做6次平行，內標法定量，方法回收率、相對標準偏差等結果見表3。

表3 不同基質類型的各醬油加標回收率 和相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of EC in different matrix types of soy sauce (n=6)

由表3可知，在不同加標水平下，各樣品加標回收率在89.4%～108.3%之間，相對標準偏差(RSD)為0.7%～6.4%，可見該方法有著良好的精密度和準確度，符合實際檢測分析要求。

2.6 實際樣品的檢測

采用本研究建立的檢測方法對市場流通度較高的9種品牌醬油進行了測定，每個樣品重復測定6次，結果見表4。

表4 市售醬油中EC的檢測結果(n=6)Table 4 The determination results of EC in soy sauce (n=6)

由表4可知，醬油樣品中EC的檢出率較高，范圍在11.98～41.70 μg/kg。

3 結論

本研究建立的四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測醬油類調味品中氨基甲酸乙酯的方法具有較好的檢測靈敏度和準確度。Q-Exactive平行反應監測模式(PRM)可以篩取EC母離子和特征碎片的精確質量數，通過比對二級碎片的同位素分布初步推導出化合物的質譜裂解模式，PRM模式針對小分子能具有較高的定性、定量水平。將優化了凈化方案的QuEChERS方法應用于醬油的前處理，使方法快速、高效、環境友好，且無基質效應，能滿足于日常監督中的快速篩查和方法確證，為調味品的質量安全監管提供了檢測方法保障。