洋甘菊各萃取相抗氧化活性及其有效成分分析

楚秉泉,方若思,李 玲,肖功年,袁海娜,龔金炎

(浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心,浙江杭州 310023)

自由基如氧自由基(ROS)導致的蛋白質變性、DNA損傷和脂質過氧化是誘發疾病、加速衰老的重要原因[1-2]。正常情況下,代謝產生的過量自由基可被機體內多種抗氧化防御系統清除,進而預防氧化應激損傷的發生[3]。而當機體處于不良環境或受到如輻射、缺氧、藥物、香煙煙霧和光化學空氣污染物等作用時,均可能造成大量自由基的產生,威脅人類健康[4]。因此,適當補充抗氧化劑,清除體內過量的自由基,維持機體氧化還原平衡,對疾病防護和人體健康具有很大的益處。

洋甘菊(MatricariarecutitaL.)又稱母菊,為菊科甘菊屬一年生或多年生草本植物,在德國、東歐、比利時、北美、英國等地區廣泛分布,在我國北方和南方也有種植[5],是一種重要的藥用植物和香料原料[6],多以其花序或全草入藥。洋甘菊甘香味微苦,含有豐富的生物活性物質。從洋甘菊花序中提煉的精油,主要成分為萜類化合物、沒藥醇、母菊蘭烯等,具有消炎、抗過敏、解痙、抑菌、清熱、治療潰瘍等功效[7-9];洋甘菊醇提取液富含的酚酸、香豆素類和黃酮類化合物,具有抗氧化、保肝護肝、抗血管增生、消炎、抗變應性和抗病毒等功效[10-11]。但目前研究多集中于洋甘菊水提物或醇提物的功能評價[12-13],少有涉及洋甘菊提取物不同部位的抗氧化活性以及相關化學成分的深入分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋甘菊 杭州藝福堂茶業有限公司;新綠原酸、綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素-7-葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、木犀草素和芹菜素標準品(純度均大于98%) 上海永恒生物科技有限公司;乙腈(色譜純) 德國Merck公司;DPPH·、ABTS+·、TPTZ、Trolox、NBT、PMS、NADH等 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鐵、過硫酸鉀等 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

BSA124s精密分析天平 賽多利斯(Sartorius)科學儀器(北京)有限公司;KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Waterse2695高效液相色譜儀(含自動進樣器、柱溫箱、2998光電二極管陣列檢測器) 美國Waters公司;Eon型酶標儀 美國伯騰(BioTek)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 洋甘菊有效成分的提取 洋甘菊50 ℃烘干后粉碎,過60目篩。準確稱取200.0 g洋甘菊粉,用無水乙醇(料液比=1∶10 g/mL)浸泡24 h后,120 W超聲提取30 min,抽濾。濾渣用無水乙醇重復超聲提取1次。合并濾液,40 ℃減壓濃縮至浸膏(無醇味),回收乙醇。浸膏用純凈水重新分散溶解,依次用體積比為1∶1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取4次,即得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和剩余水相。分別40 ℃減壓濃縮至干后,-40 ℃冷凍干燥36 h。各凍干物用甲醇配制成相應濃度的待測樣本,4 ℃保存備用。

1.2.2 各提取組分的抗氧化活性

1.2.2.1 DPPH·清除實驗 用甲醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液,現配現用。取0.1 mL不同質量濃度的待測樣本與3.9 mL DPPH·溶液混勻;待測樣空白對照組為相應質量濃度待測樣本0.1 mL加入3.9 mL甲醇;DPPH·空白對照組為3.9 mL DPPH·加入0.1 mL甲醇。室溫下避光反應30 min后,在517 nm波長下測定吸光度值。另以不同質量濃度的VC溶液作為陽性對照[14]。按下列公式計算各樣本的DPPH·清除率,并計算各待測樣本的半抑制濃度(IC50)。實驗重復3次。

DPPH·清除率(%)=[1-(A待測樣-A待測樣空白對照)/ADPPH·空白對照]×100

1.2.2.2 ABTS+·清除實驗 用純水配制2.45 mmol/L過硫酸鉀和7 mmol/L ABTS+·混合溶液。室溫下避光靜置16 h,制成ABTS+·儲備液。臨用前用純水稀釋至吸光值為0.700±0.02(734 nm)的ABTS+·工作液。分別取0.1 mL不同質量濃度的待測樣本加入3.9 mL的ABTS+·工作液;待測樣空白對照組為相應質量濃度待測樣本0.1 mL加入3.9 mL的純水;ABTS+·空白對照組為3.9 mL ABTS+·工作液加入0.1 mL甲醇。混勻后室溫下反應6 min,在734 nm波長下測定吸光值。另以不同質量濃度的VC溶液作為陽性對照。按下列公式計算各樣本的ABTS+·清除率,并計算各待測樣本的半抑制濃度(IC50)[14]。實驗重復3次。

ABTS+·清除率(%)=[1-(A待測樣-A待測樣空白對照)/AABTS·空白對照]×100

1.2.2.4 FRAP法測定還原能力 參考文獻[15]方法,略有修改。配制100 mmol/L醋酸緩沖液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液(40 mmol/L鹽酸溶液配制)和20 mmol/L氯化鐵溶液,按10∶1∶1的比例進行混勻后得RFAP工作液,現配現用。取3.9 mL RFAP工作液,加入0.1 mL 0.5 mg/mL的待測樣本(濃度由預實驗測得),混合均勻后,在37 ℃的恒溫水浴中反應10 min后于593 nm下測定吸光度值,以甲醇為空白對照。結果表達為每克干重相當于Trolox還原力的相當量(mg trolox equivalent antioxidant capacity/g dry weight,mg TEAC/g DW)。實驗重復3次。

1.2.3 最佳抗氧化活性組分成分分析 將抗氧化活性最佳的萃取相(乙酸乙酯萃取相)冷凍干燥后用甲醇配制10 mg/mL樣本,4 ℃保存備用。

1.2.3.1 總黃酮和總酚的測定 參照文獻[16]方法,以蘆丁為標準品,亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法(510 nm)建立標準曲線,測定乙酸乙酯萃取相中的總黃酮含量(%);以沒食子酸為標準品,福林酚顯色法(570 nm)建立標準曲線,測定乙酸乙酯萃取相中的總酚含量(%)。

1.2.3.2 多酚化合物組分分析 用甲醇配制新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草素-7-葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸C、1,3-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷、木犀草素和芹菜素標準品的混合溶液,4 ℃保存備用。

液相色譜條件及測定方法:色譜柱為Luna-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A:乙腈,流動相B:0.1%磷酸溶液。流速0.8 mL/min,檢測波長330 nm,進樣量10 μL,柱溫35 ℃,梯度洗脫條件見表1。標準曲線法定量待測樣本中多酚成分組成。

表1 流動相梯度條件Table 1 HPLC gradient elution conditions

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 洋甘菊醇提物各萃取相的抗氧化活性比較

圖1 洋甘菊醇提物不同極性組分對DPPH·的清除作用

圖2 洋甘菊醇提物不同極性組分對ABTS+·的清除作用

圖3 洋甘菊醇提物不同極性組分對的清除作用 scavenging capacity of different polar fractions of chamomile alcohol extracts

表2 洋甘菊醇提物不同極性組分的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of different polar fractions of chamomile alcohol

2.2 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中總酚和總黃酮含量

多酚和黃酮具有多個酚羥基結構,是天然產物中主要的抗氧化成分之一,具有豐富的藥理活性[17-18]。實驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法(以蘆丁為標準品)和福林酚顯色法(以沒食子酸為標準品)分別對洋甘菊抗氧化活性最強的乙酸乙酯萃取相中的總黃酮和總酚含量進行分析。結果表明,蘆丁和沒食子酸的標準曲線方程分別為y=0.0761x+0.001(R2=0.9936)和y=0.1852x+0.0057(R2=0.9996),以此標準曲線計算得總酚和總黃酮含量分別為25.84%和14.93%(圖4),推測該萃取相較強的抗氧化活性可能與其豐富的酚類和黃酮類化合物有關。

圖4 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中總酚和總黃酮含量(n=3)

2.3 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中多酚或黃酮成分分析

進一步采用HPLC法分析乙酸乙酯組分中的多酚或黃酮成分(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素-7-葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、木犀草素和芹菜素)的含量。通過標準品與樣本HPLC圖譜中保留時間及各色譜峰的紫外吸收譜吻合度比對(圖5),結合外標法對樣本中10種多酚或黃酮成分進行定性定量分析,結果如表3所示。10種化合物在洋甘菊中均被檢出,采用標準曲線法測定各組分的含量。結果表明,洋甘菊乙酸乙酯組分中木犀草素含量最高,為7.057 mg/g DW,其次是蒙花苷和木犀草素-7-葡萄糖,分別為5.736和5.605 mg/g DW(表3),而這些化合物均被報道具有較好的抗氧化活性[19-21],表明洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分良好的抗氧化能力可能與其豐富的多酚和黃酮有關。

圖5 待測樣本(A)和混合標準品溶液(B)的HPLC圖

表3 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中多酚或黃酮成分及含量

出峰編號化合物出峰時間(min)含量(mg/g DW)1新綠原酸7.4210.295±0.0262綠原酸10.8584.389±0.2843隱綠原酸11.3611.328±0.08841,3-二咖啡酰奎寧酸15.3390.642±0.0535木犀草素-7-葡萄糖24.0295.605±0.3896異綠原酸B29.6611.340±0.0677異綠原酸C40.5343.094±0.1118蒙花苷46.3775.736±0.3459木犀草素48.0817.057±0.62810芹菜素53.7952.467±0.291

3 結論

本實驗采用4種抗氧化評價方法，較系統地對比分析了洋甘菊醇提物不同極性(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水相)萃取組分的抗氧化活性,結果發現乙酸乙酯萃取相活性最佳。對乙酸乙酯萃取相中總酚和總黃酮含量進行測定,兩種成分分別為25.84%和14.93%,說明洋甘菊是一種富含多酚和黃酮成分的植物;進一步采用HPLC測定了乙酸乙酯萃取相中的10種多酚或黃酮類化合物,表明木犀草素、蒙花苷和木犀草素-7-葡萄糖含量較豐富。

在未來的研究中,我們將進一步明確起主要抗氧化作用的多酚/黃酮類化合物及其量效關系;關于洋甘菊提取物的體內抗氧化功能及其作用機制研究也將在后續的工作中展開。